Hypertrofická kardiomyopatie (HCM) je dědičné onemocnění způsobené mutacemi v genech pro sarkomerické proteiny. HCM se vyskytuje asi u 0,2 % dospělé populace. Nejzávažnějším a často prvním projevem HCM je náhlá smrt.
Cílem diplomové práce bylo genetické vyšetření skupiny pacientů s diagnózou hypertrofické kardiomyopatie. Byly analyzovány geny pro myozinový vazebný protein C (MyBPC3) a troponin T (TNNT2).
Fragmenty genů MyBPC3 a TNNT2 jsme amplifikovali polymerázovou řetězovou reakcí, u které jsme optimalizovali teploty annealingu pro jednotlivé exony. Poté jsme pomocí konformačního polymorfismu jednořetězců určili migrační vzory u analyzovaných PCR produktů. Produkty, které vykazovaly odlišnou mobilitu ve srovnání se standardními vzorky jsme sekvenovali, a tím určili primární strukturu DNA. Odhalené sekvenční změny jsme porovnávali s databázemi mutací a dostupnou literaturou.
Mutační analýzou jsme vyšetřili 33 exonů genu MyBPC3 a 15 exonů genu TNNT2 celkem u 47 pacientů.
V případě genu MyBPC3 bylo detekováno 18 typů změn u 31 (66 %) pacientů.
U 27 (57 %) pacientů jsme určili 31 polymorfismů. Identifikovali jsme 5 mutací u 4 (9 %) pacientů. V této skupině pacientů jsme detekovali čtyři frameshift mutace a jednu missense mutaci. Dále jsme u 18 (38 %) pacientů objevili 35 změn nejasného významu.
V genu pro troponin T jsme odhalili 10 typů změn u 47 (100 %) pacientů. Celkem jsme v této skupině pacientů detekovali 185 polymorfismů čtyř typů v homozygotní i heterozygotní formě. Dále jsme u 45 (96 %) pacientů identifikovali 112 intronových změn nejasného významu.
Výsledky získané během této studie budou zavedeny do rutinní praxe
v Laboratoři molekulární biologie Onkologického centra J. G. Mendela
Anotace v angličtině
Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a hereditary disease caused by mutations in genes for sarcomeric proteins. HCM occurs in about 0.2% of the adult population. The most serious and often the first manifestation of HCM is sudden death.
The aim of this work was a genetic screening of group of patients with hypertrophic cardiomyopathy. We analysed genes encoding myosin binding protein C (MyBPC3) and troponin T (TNNT2).
We amplified fragments of genes MyBPC3 and TNNT2 by polymerase chain reaction (PCR). We optimised annealing temperatures for each exon. Then we used single-strand conformation polymorphism (SSCP) for determination of migration patterns of analysed PCR products. Subsequently we sequenced products that showed a different mobility compared to standard samples. So we could determine the primary structure of DNA. Detected sequence changes were compared with databases of mutations and the available literature.
We examined 33 exons of the gene MyBPC3 and 15 exons of the gene TNNT2 in group of 47 patients by SSCP and sequencing analysis.
We detected 18 types of changes in the gene MyBPC3 in 31 (66%) patients. We detected 31 polymorphisms in group of 27 (57%) patients. We identified five pathogenic mutations in 4 (9%) patients. In this group we detected four frameshift mutations and one missense mutation. We also found 35 changes of unknown significance in 18 (38%) patients.
In the gene TNNT2 we found 10 types of changes in 47 (100%) patients. We totally detected 185 polymorphisms (homozygous and heterozygous form) in 47 (100%) patients. We also found 112 intron changes of unknown significance in 45 (96%) patiens.
Our results will be implicated in routine diagnostic in the laboratory of molecular biology.
Hypertrofická kardiomyopatie (HCM) je dědičné onemocnění způsobené mutacemi v genech pro sarkomerické proteiny. HCM se vyskytuje asi u 0,2 % dospělé populace. Nejzávažnějším a často prvním projevem HCM je náhlá smrt.
Cílem diplomové práce bylo genetické vyšetření skupiny pacientů s diagnózou hypertrofické kardiomyopatie. Byly analyzovány geny pro myozinový vazebný protein C (MyBPC3) a troponin T (TNNT2).
Fragmenty genů MyBPC3 a TNNT2 jsme amplifikovali polymerázovou řetězovou reakcí, u které jsme optimalizovali teploty annealingu pro jednotlivé exony. Poté jsme pomocí konformačního polymorfismu jednořetězců určili migrační vzory u analyzovaných PCR produktů. Produkty, které vykazovaly odlišnou mobilitu ve srovnání se standardními vzorky jsme sekvenovali, a tím určili primární strukturu DNA. Odhalené sekvenční změny jsme porovnávali s databázemi mutací a dostupnou literaturou.
Mutační analýzou jsme vyšetřili 33 exonů genu MyBPC3 a 15 exonů genu TNNT2 celkem u 47 pacientů.
V případě genu MyBPC3 bylo detekováno 18 typů změn u 31 (66 %) pacientů.
U 27 (57 %) pacientů jsme určili 31 polymorfismů. Identifikovali jsme 5 mutací u 4 (9 %) pacientů. V této skupině pacientů jsme detekovali čtyři frameshift mutace a jednu missense mutaci. Dále jsme u 18 (38 %) pacientů objevili 35 změn nejasného významu.
V genu pro troponin T jsme odhalili 10 typů změn u 47 (100 %) pacientů. Celkem jsme v této skupině pacientů detekovali 185 polymorfismů čtyř typů v homozygotní i heterozygotní formě. Dále jsme u 45 (96 %) pacientů identifikovali 112 intronových změn nejasného významu.
Výsledky získané během této studie budou zavedeny do rutinní praxe
v Laboratoři molekulární biologie Onkologického centra J. G. Mendela
Anotace v angličtině
Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a hereditary disease caused by mutations in genes for sarcomeric proteins. HCM occurs in about 0.2% of the adult population. The most serious and often the first manifestation of HCM is sudden death.
The aim of this work was a genetic screening of group of patients with hypertrophic cardiomyopathy. We analysed genes encoding myosin binding protein C (MyBPC3) and troponin T (TNNT2).
We amplified fragments of genes MyBPC3 and TNNT2 by polymerase chain reaction (PCR). We optimised annealing temperatures for each exon. Then we used single-strand conformation polymorphism (SSCP) for determination of migration patterns of analysed PCR products. Subsequently we sequenced products that showed a different mobility compared to standard samples. So we could determine the primary structure of DNA. Detected sequence changes were compared with databases of mutations and the available literature.
We examined 33 exons of the gene MyBPC3 and 15 exons of the gene TNNT2 in group of 47 patients by SSCP and sequencing analysis.
We detected 18 types of changes in the gene MyBPC3 in 31 (66%) patients. We detected 31 polymorphisms in group of 27 (57%) patients. We identified five pathogenic mutations in 4 (9%) patients. In this group we detected four frameshift mutations and one missense mutation. We also found 35 changes of unknown significance in 18 (38%) patients.
In the gene TNNT2 we found 10 types of changes in 47 (100%) patients. We totally detected 185 polymorphisms (homozygous and heterozygous form) in 47 (100%) patients. We also found 112 intron changes of unknown significance in 45 (96%) patiens.
Our results will be implicated in routine diagnostic in the laboratory of molecular biology.
1) Teoretická část:
" obecný přehled kardiomyopatií, úvod o hypertrofické kardiomyopatii, charakteristika onemocnění, základní klinické příznaky, diagnostické přístupy
" dědičnost onemocnění, kandidátní geny, jejich struktura, patogeneze
" korelace genotypu a fenotypu, genetická a klinická heterogenita
" možnosti genetické diagnostiky v rodinách pacientů a prenatální diagnostika, genetická prognóza
" metody analýzy nukleových kyselin
2) Praktická část:
" výběr vhodné metody pro izolaci genomové DNA z periferní krve pacientů
" optimalizace reakčních podmínek PCR pro amplifikaci všech kódujících úseků dvou kauzálních genů (MYBPC3, TNNT2)
" detekce mutací pomocí SSCP (single-strand conformation polymorphism), analýza migračních vzorů
" stanovení primární struktury DNA metodou přímé sekvence
" popis nalezených změn na úrovni DNA, hodnocení výsledků a porovnání se světovými databázemi
Zásady pro vypracování
1) Teoretická část:
" obecný přehled kardiomyopatií, úvod o hypertrofické kardiomyopatii, charakteristika onemocnění, základní klinické příznaky, diagnostické přístupy
" dědičnost onemocnění, kandidátní geny, jejich struktura, patogeneze
" korelace genotypu a fenotypu, genetická a klinická heterogenita
" možnosti genetické diagnostiky v rodinách pacientů a prenatální diagnostika, genetická prognóza
" metody analýzy nukleových kyselin
2) Praktická část:
" výběr vhodné metody pro izolaci genomové DNA z periferní krve pacientů
" optimalizace reakčních podmínek PCR pro amplifikaci všech kódujících úseků dvou kauzálních genů (MYBPC3, TNNT2)
" detekce mutací pomocí SSCP (single-strand conformation polymorphism), analýza migračních vzorů
" stanovení primární struktury DNA metodou přímé sekvence
" popis nalezených změn na úrovni DNA, hodnocení výsledků a porovnání se světovými databázemi
Seznam doporučené literatury
podle pokynů vedoucího diplomové práce
Seznam doporučené literatury
podle pokynů vedoucího diplomové práce
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce
3. Diplomantka zodpověděla všechny dotazy a přípomínky k DP