CÍL: V naší práci jsme se věnovali studiu účinku inhibitoru NU7441, který specificky inhibuje DNA-dependentní protein kinázu (DNA-PK). Zabývali jsme se jeho efektem na inhibici reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DSBs) a indukci apoptózy v kombinaci s ionizujícím zářením (IZ). Inhibitor jsme použili v koncentraci 1 ?M a záření o dávce 1 Gy. Dále jsme provedli doplňkové experimenty k předchozí studii s inhibitorem NU7026, který méně specificky inhibuje DNA-PK a také ATM-kinázu (ATM), ovšem za použití vyšší koncentrace (10 ?M) a pokusili jsme se srovnat účinek obou inhibitorů.
MATERIÁL A METODY: Buňky T-lymfocytární leukemické buněčné linie MOLT-4 byly pro experimentální část práce rozděleny do čtyř skupin: kontrolní buňky, buňky ovlivněné inhibitorem NU7441 a v některých (doplňkových) pokusech inhibitorem NU7026, buňky ozářené dávkou 1 Gy a buňky ovlivněné kombinací obou nox. Využili jsme Western blotting a ELISA stanovení pro analýzu proteinů účastnících se reparace DNA a indukce apoptózy a epifluorescenční mikroskopii pro detekci kolokalizace proteinů ?H2AX a 53BP1; tzv. ložiska indukovaná IZ (ionizing radiation-induced foci; IRIF). Pro zhodnocení apoptózy jsme využili průtokovou cytometrii.
VÝSLEDKY: Nepozorovali jsme signifikantní změnu v množství DNA-PK podjednotek Ku70/80. Samotné ozáření vedlo k nárůstu exprese proteinu p53 a jeho fosforylací na pozicích Ser 392 a Ser 15. V důsledku toho byla zvýšena exprese proteinu p21. Pre-inkubace s NU7441 nevedla k inhibici fosforylace p53, jelikož je prováděna současně také ATM. Množství cdc25A mírně kleslo po použití kombinace nox. Inhibitor NU7026 v kombinaci s dávkou 1 Gy tlumil fosforylace některých substrátů ATM a DNA-PK, ovšem výsledná míra apoptózy byla vyšší po použití inhibitoru NU7441. Co se týče indukce apoptózy, tak kombinace IZ a NU7441 vedla ke snížení množství anti-apoptického proteinu Mcl-1 a štěpení poly (ADP-ribóza) polymerázy (PARP), což je známkou probíhající apoptózy. Množství pro-apoptického proteinu Bad kleslo mírně pouze za 72 hod po ozáření po použití kombinace. Detekovali jsme zvýšené množství apoptických buněk 24 i 72 hod po ozáření ve skupině buněk ovlivněných kombinací nox. Množství IRIF bylo také u kombinace zvýšeno.
ZÁVĚR: Kombinace IZ a inhibitoru DNA-PK NU7441 způsobila zvýšení DNA poškození a následně indukci buněčné smrti. Nevedla k snížení exprese proteinu p53, jeho fosforylovaných forem nebo proteinu p21. Došlo ale ke snížení anti-apoptického Mcl-1 a byla významně indukována apoptóza 72 hod po ozáření. Protože jej lze použít v nižších koncentracích než inhibitor NU7026 a vede k intenzivnějšímu pro-apoptickému účinku, hodnotíme inhibitor NU7441 jako perspektivní platformu pro vývoj dalších účinných protinádorových léčiv.
Anotace v angličtině
BACKGROUND: In this study we describe the effect of NU7441, a specific inhibitor of DNA-dependent protein kinases (DNA-PK), on molecular mechanisms of inhibition of double strand breaks (DSBs) repair and induction of apoptosis triggered by ionising radiation (IR). We studied the effect of pre-treatment with NU7441 (1?M) prior irradiation (1 Gy). We also conducted some complementary experiments to our previous study with inhibitor NU7026, which less specifically inhibits DNA-PK and also ATM-kinase (ATM), however at higher concentration (10 ?M) and we tried to mutually compare the effect of both inhibitors.
METHODS: The experimental design consisted of four groups: control, NU7441 treated, IR-treated, and combination. We used flow-cytometry for apoptosis assessment, Western-blotting and ELISA for detection of proteins involved in DNA repair signalling pathways and epifluorescence microscopy for detection of co-localisation of ?H2AX and 53BP1, i.e. ionising radiation-induced foci (IRIF).
RESULTS: We did not observe any significant changes in the amount of DNA-PK subunits Ku70/80. IR alone led to up-regulation of p53 and its phosphorylation at serine 15 and 392 (crucial for DNA-binding and its function as a tumour suppressor). This subsequently resulted in up-regulation of p21. However, the combination did not induce decrease, since phosphorylation of p53 can be performed also by ATM. The amount of cdc25A decreased slightly after combination of IR with NU7441 72 h after irradiaiton.
In the terms of cell death, combination of IR with NU7441 induced decrease in anti-apoptotic Mcl-1 and a significant hallmark of apoptosis - cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). The amount of pro-apoptotic Bad slightly decreased only 72 h after irradiation and pre-treatment with NU7026. We detected significant increase in apoptotic cells in the group with combination of NU7441 and IR also by flow-cytometry and combination led to substantial increase in the accumulation of IRIF.
CONCLUSIONS: Taken together, combination of DNA-PK inhibitor (NU7441) with IR causes accumulation of DNA damage and subsequent cell death. It does not lead to decrease in amount of p53 phosphorylation or p21, but to decrease in anti-apoptotic Mcl-1 and significantly induces apoptosis 72 h after irradiation. Since NU7441 can be used at lower concentration than NU7026 and it is capable of intensive pro-apoptotic effect, we conclude that NU7441 could provide a perspective platform for development of radio-sensitizers in radiotherapy.
DNA-PK, ATM, DNA double-strand breaks, inhibitor NU7441, ionising radiation, apoptosis
Rozsah průvodní práce
86
Jazyk
CZ
Anotace
CÍL: V naší práci jsme se věnovali studiu účinku inhibitoru NU7441, který specificky inhibuje DNA-dependentní protein kinázu (DNA-PK). Zabývali jsme se jeho efektem na inhibici reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DSBs) a indukci apoptózy v kombinaci s ionizujícím zářením (IZ). Inhibitor jsme použili v koncentraci 1 ?M a záření o dávce 1 Gy. Dále jsme provedli doplňkové experimenty k předchozí studii s inhibitorem NU7026, který méně specificky inhibuje DNA-PK a také ATM-kinázu (ATM), ovšem za použití vyšší koncentrace (10 ?M) a pokusili jsme se srovnat účinek obou inhibitorů.
MATERIÁL A METODY: Buňky T-lymfocytární leukemické buněčné linie MOLT-4 byly pro experimentální část práce rozděleny do čtyř skupin: kontrolní buňky, buňky ovlivněné inhibitorem NU7441 a v některých (doplňkových) pokusech inhibitorem NU7026, buňky ozářené dávkou 1 Gy a buňky ovlivněné kombinací obou nox. Využili jsme Western blotting a ELISA stanovení pro analýzu proteinů účastnících se reparace DNA a indukce apoptózy a epifluorescenční mikroskopii pro detekci kolokalizace proteinů ?H2AX a 53BP1; tzv. ložiska indukovaná IZ (ionizing radiation-induced foci; IRIF). Pro zhodnocení apoptózy jsme využili průtokovou cytometrii.
VÝSLEDKY: Nepozorovali jsme signifikantní změnu v množství DNA-PK podjednotek Ku70/80. Samotné ozáření vedlo k nárůstu exprese proteinu p53 a jeho fosforylací na pozicích Ser 392 a Ser 15. V důsledku toho byla zvýšena exprese proteinu p21. Pre-inkubace s NU7441 nevedla k inhibici fosforylace p53, jelikož je prováděna současně také ATM. Množství cdc25A mírně kleslo po použití kombinace nox. Inhibitor NU7026 v kombinaci s dávkou 1 Gy tlumil fosforylace některých substrátů ATM a DNA-PK, ovšem výsledná míra apoptózy byla vyšší po použití inhibitoru NU7441. Co se týče indukce apoptózy, tak kombinace IZ a NU7441 vedla ke snížení množství anti-apoptického proteinu Mcl-1 a štěpení poly (ADP-ribóza) polymerázy (PARP), což je známkou probíhající apoptózy. Množství pro-apoptického proteinu Bad kleslo mírně pouze za 72 hod po ozáření po použití kombinace. Detekovali jsme zvýšené množství apoptických buněk 24 i 72 hod po ozáření ve skupině buněk ovlivněných kombinací nox. Množství IRIF bylo také u kombinace zvýšeno.
ZÁVĚR: Kombinace IZ a inhibitoru DNA-PK NU7441 způsobila zvýšení DNA poškození a následně indukci buněčné smrti. Nevedla k snížení exprese proteinu p53, jeho fosforylovaných forem nebo proteinu p21. Došlo ale ke snížení anti-apoptického Mcl-1 a byla významně indukována apoptóza 72 hod po ozáření. Protože jej lze použít v nižších koncentracích než inhibitor NU7026 a vede k intenzivnějšímu pro-apoptickému účinku, hodnotíme inhibitor NU7441 jako perspektivní platformu pro vývoj dalších účinných protinádorových léčiv.
Anotace v angličtině
BACKGROUND: In this study we describe the effect of NU7441, a specific inhibitor of DNA-dependent protein kinases (DNA-PK), on molecular mechanisms of inhibition of double strand breaks (DSBs) repair and induction of apoptosis triggered by ionising radiation (IR). We studied the effect of pre-treatment with NU7441 (1?M) prior irradiation (1 Gy). We also conducted some complementary experiments to our previous study with inhibitor NU7026, which less specifically inhibits DNA-PK and also ATM-kinase (ATM), however at higher concentration (10 ?M) and we tried to mutually compare the effect of both inhibitors.
METHODS: The experimental design consisted of four groups: control, NU7441 treated, IR-treated, and combination. We used flow-cytometry for apoptosis assessment, Western-blotting and ELISA for detection of proteins involved in DNA repair signalling pathways and epifluorescence microscopy for detection of co-localisation of ?H2AX and 53BP1, i.e. ionising radiation-induced foci (IRIF).
RESULTS: We did not observe any significant changes in the amount of DNA-PK subunits Ku70/80. IR alone led to up-regulation of p53 and its phosphorylation at serine 15 and 392 (crucial for DNA-binding and its function as a tumour suppressor). This subsequently resulted in up-regulation of p21. However, the combination did not induce decrease, since phosphorylation of p53 can be performed also by ATM. The amount of cdc25A decreased slightly after combination of IR with NU7441 72 h after irradiaiton.
In the terms of cell death, combination of IR with NU7441 induced decrease in anti-apoptotic Mcl-1 and a significant hallmark of apoptosis - cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). The amount of pro-apoptotic Bad slightly decreased only 72 h after irradiation and pre-treatment with NU7026. We detected significant increase in apoptotic cells in the group with combination of NU7441 and IR also by flow-cytometry and combination led to substantial increase in the accumulation of IRIF.
CONCLUSIONS: Taken together, combination of DNA-PK inhibitor (NU7441) with IR causes accumulation of DNA damage and subsequent cell death. It does not lead to decrease in amount of p53 phosphorylation or p21, but to decrease in anti-apoptotic Mcl-1 and significantly induces apoptosis 72 h after irradiation. Since NU7441 can be used at lower concentration than NU7026 and it is capable of intensive pro-apoptotic effect, we conclude that NU7441 could provide a perspective platform for development of radio-sensitizers in radiotherapy.
DNA-PK, ATM, DNA double-strand breaks, inhibitor NU7441, ionising radiation, apoptosis
Zásady pro vypracování
1) Teoretická část:
a. Obecný úvod o účinku ionizujícího záření a poškození DNA
b. Rešerše zaměřená na reparační mechanismy, popsání rodiny PI-3 kináz, substráty, buněčná signalizace, indukce apoptózy
c. Rešerše zaměřená na možnosti inhibice reparačních enzymů, inhibitory DNA-PK
2) Praktická část:
a. Zvládnutí základních technik kultivace buněčných linií, příprava vzorků buněčnou lýzou, měření koncentrace celkového proteinu.
b. Zavedení SDS-PAGE jednorozměrné elektroforézy s následnou detekcí Western blottingem dle stávajících postupů. Optimalizace ředění nově zaváděných protilátek.
c. Zavedení detekce vybraných proteinů pomocí ELISA.
d. Zavedení detekce vybraných proteinů mikroskopicky.
e. Zhodnocení exprese a post-translačních modifikací substrátů ATM kinasy a DNA-dependentní protein kinasy a dalších proteinů analyzovaných imunodetekčními technikami.
f. Adekvátní statistické zpracování naměřených hodnot a vyvození, zda a jakým způsobem ovlivňuje inhibice reparace radiačního poškození indukci apoptózy s ohledem na potenciaci účinku ionizujícího záření.
Zásady pro vypracování
1) Teoretická část:
a. Obecný úvod o účinku ionizujícího záření a poškození DNA
b. Rešerše zaměřená na reparační mechanismy, popsání rodiny PI-3 kináz, substráty, buněčná signalizace, indukce apoptózy
c. Rešerše zaměřená na možnosti inhibice reparačních enzymů, inhibitory DNA-PK
2) Praktická část:
a. Zvládnutí základních technik kultivace buněčných linií, příprava vzorků buněčnou lýzou, měření koncentrace celkového proteinu.
b. Zavedení SDS-PAGE jednorozměrné elektroforézy s následnou detekcí Western blottingem dle stávajících postupů. Optimalizace ředění nově zaváděných protilátek.
c. Zavedení detekce vybraných proteinů pomocí ELISA.
d. Zavedení detekce vybraných proteinů mikroskopicky.
e. Zhodnocení exprese a post-translačních modifikací substrátů ATM kinasy a DNA-dependentní protein kinasy a dalších proteinů analyzovaných imunodetekčními technikami.
f. Adekvátní statistické zpracování naměřených hodnot a vyvození, zda a jakým způsobem ovlivňuje inhibice reparace radiačního poškození indukci apoptózy s ohledem na potenciaci účinku ionizujícího záření.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce
3. Diplomant zodpověděl všechny dotazy a připomínky k DP