Cílem této práce bylo objasnit význam inhibice reparace radiačního poškození DNA. Zaměřili jsme se na vliv inhibitoru DNA-dependentní protein kinázy (DNA-PK) NU7441 a inhibitoru ATM kinázy KU55933. Zjišťovali jsme účinnost inhibitorů použitých individuálně, zároveň a také v kombinaci s gama zářením 60Co. Jako modelový systém byly použity nádorové buňky HeLa, odvozené od lidského cervikálního karcinomu.
Ke stanovení buněčného růstu jsme využili stanovení klonogenity a test buněčné proliferace (WST test). Pomocí fluorescenční mikroskopie jsme detekovali přítomnost tzv. zářením indukovaných ložisek (?ionizing radiation induced foci?, IRIF). Zjišťovali jsme také změny v zastoupení buněk ve fázích buněčného cyklu (průtoková cytometrie) a expresi některých proteinů účastnících se opravy DNA poškození (Western blotting).
Z námi získaných výsledků vyplývá, že inhibitory DNA-PK (NU7441) a ATM kinázy (KU55933) mají na nádorové HeLa buňky radiosenzibilizující efekt, který se prohlubuje v případě, že použijeme kombinaci obou inhibitorů. Tato kombinace si proto zaslouží další pozornost při hledání nových strategií kombinované léčby nádorových onemocnění.
Anotace v angličtině
The aim of the thesis was to clarify the importance of inhibition of repair DNA damage caused by ionizing radiation. We focused on the effect of an inhibitor of the DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) NU7441 and the inhibitor ATM kinase KU55933. We examined the effectiveness of inhibitors used individually, together, and in combination with 60Co gamma rays. Cell line HeLa, derived from human cervical carcinoma, was used as a model system.
First, we used methods to determine cell growth (colony formation assay) and cell proliferation (WST test). Using fluorescence microscopy, we detected the presence of the "ionizing radiation induced foci" (IRIF). We observed the changes in amount of cells in the phases of the cell cycle (flow cytometry) and the expression of some proteins involved in the repair of DNA damage (Western blotting).
Our results show that inhibitors of DNA-PK (NU7441) and ATM kinase (KU55933) have an radiosentising effect on tumor HeLa cells which becomes stronger when the combination of both inhibitors is used. This novel approach might offer new strategies in combined treatment of tumor diseases.
Cílem této práce bylo objasnit význam inhibice reparace radiačního poškození DNA. Zaměřili jsme se na vliv inhibitoru DNA-dependentní protein kinázy (DNA-PK) NU7441 a inhibitoru ATM kinázy KU55933. Zjišťovali jsme účinnost inhibitorů použitých individuálně, zároveň a také v kombinaci s gama zářením 60Co. Jako modelový systém byly použity nádorové buňky HeLa, odvozené od lidského cervikálního karcinomu.
Ke stanovení buněčného růstu jsme využili stanovení klonogenity a test buněčné proliferace (WST test). Pomocí fluorescenční mikroskopie jsme detekovali přítomnost tzv. zářením indukovaných ložisek (?ionizing radiation induced foci?, IRIF). Zjišťovali jsme také změny v zastoupení buněk ve fázích buněčného cyklu (průtoková cytometrie) a expresi některých proteinů účastnících se opravy DNA poškození (Western blotting).
Z námi získaných výsledků vyplývá, že inhibitory DNA-PK (NU7441) a ATM kinázy (KU55933) mají na nádorové HeLa buňky radiosenzibilizující efekt, který se prohlubuje v případě, že použijeme kombinaci obou inhibitorů. Tato kombinace si proto zaslouží další pozornost při hledání nových strategií kombinované léčby nádorových onemocnění.
Anotace v angličtině
The aim of the thesis was to clarify the importance of inhibition of repair DNA damage caused by ionizing radiation. We focused on the effect of an inhibitor of the DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) NU7441 and the inhibitor ATM kinase KU55933. We examined the effectiveness of inhibitors used individually, together, and in combination with 60Co gamma rays. Cell line HeLa, derived from human cervical carcinoma, was used as a model system.
First, we used methods to determine cell growth (colony formation assay) and cell proliferation (WST test). Using fluorescence microscopy, we detected the presence of the "ionizing radiation induced foci" (IRIF). We observed the changes in amount of cells in the phases of the cell cycle (flow cytometry) and the expression of some proteins involved in the repair of DNA damage (Western blotting).
Our results show that inhibitors of DNA-PK (NU7441) and ATM kinase (KU55933) have an radiosentising effect on tumor HeLa cells which becomes stronger when the combination of both inhibitors is used. This novel approach might offer new strategies in combined treatment of tumor diseases.
1. Proveďte literární rešerši a popište současný stav poznání o účinku ionizujícího záření v radioterapii cervikálního karcinomu. Popište radiosenzitivitu HeLa buněk. Popište vliv DNA-PK a ATM kinasy na reparaci radiačního poškození. Popište možnosti inhibice těchto kinas a její vliv na nádorové buňky.
2. Osvojte si techniku práce s buněčnou linií HeLa, její kultivaci a pasážování.
3. Zhodnoťte vliv inhibitorů DNA-PK NU7441 a ATM kinasy KU55933 a jejich kombinace na ozářené buňky, pomocí sledování proliferační aktivity buněk.
4. Osvojte si práci s průtokovým cytometrem a popište vliv inhibitorů DNA-PK NU7441 a ATM kinasy KU55933 a jejich kombinace na ozářené buňky a změny v zastoupení buněk v buněčném cyklu.
5. Osvojte si práci s fluorescenčním mikroskopem a popište vliv inhibitorů DNA-PK NU7441 a ATM kinasy KU55933 a jejich kombinace na ozářené buňky a změny v kolokalizaci gamaH2AX a 53BP1 v jednotlivých buňkách.
6. Stanovte změny vybraných proteinů 2 h po ozáření pomocí metody western blot.
7. Naměřené hodnoty statisticky zpracujte a ze získaných výsledků vyvoďte, zda a jakým způsobem ovlivňují vybrané inhibitory a jejich kombinace radiosenzitivitu Hela buněk.
Zásady pro vypracování
1. Proveďte literární rešerši a popište současný stav poznání o účinku ionizujícího záření v radioterapii cervikálního karcinomu. Popište radiosenzitivitu HeLa buněk. Popište vliv DNA-PK a ATM kinasy na reparaci radiačního poškození. Popište možnosti inhibice těchto kinas a její vliv na nádorové buňky.
2. Osvojte si techniku práce s buněčnou linií HeLa, její kultivaci a pasážování.
3. Zhodnoťte vliv inhibitorů DNA-PK NU7441 a ATM kinasy KU55933 a jejich kombinace na ozářené buňky, pomocí sledování proliferační aktivity buněk.
4. Osvojte si práci s průtokovým cytometrem a popište vliv inhibitorů DNA-PK NU7441 a ATM kinasy KU55933 a jejich kombinace na ozářené buňky a změny v zastoupení buněk v buněčném cyklu.
5. Osvojte si práci s fluorescenčním mikroskopem a popište vliv inhibitorů DNA-PK NU7441 a ATM kinasy KU55933 a jejich kombinace na ozářené buňky a změny v kolokalizaci gamaH2AX a 53BP1 v jednotlivých buňkách.
6. Stanovte změny vybraných proteinů 2 h po ozáření pomocí metody western blot.
7. Naměřené hodnoty statisticky zpracujte a ze získaných výsledků vyvoďte, zda a jakým způsobem ovlivňují vybrané inhibitory a jejich kombinace radiosenzitivitu Hela buněk.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce
3. Diplomantka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP