Tato diplomová práce se zabývá optimalizací preanalytické úpravy vzorků pro analýzu fosfopeptidů pomocí kapilární zónové elektroforézy ve spojení s UV detekcí. Jako modelový fosfoprotein, na kterém byly testovány postupy úpravy vzorku, byl vybrán hovězím ?-kasein, který byl štěpen proteolytickým enzymem trypsinem. Fosfopeptidy, obsažené v naštěpeném vzorku, byly obohaceny na titanových částicích a defosforylovány imobilizovanou alkalickou fosfatázou. Všechny kroky úpravy modelového vzorku byly ověřovány pomocí MALDI LTQ Orbitrap hmotnostní spektrometrie.
Anotace v angličtině
This diploma thesis was focused on optimization of sample preparation for the analysis of phosphopeptides using capillary zone electrophoresis in connection with UV detection. All sample preparation steps were tested on bovine ?-casein, which was chosen as a standard phosphoprotein. Sample of ?-casein was digested by the proteolytic enzyme trypsin. Phosphopeptides occurring in the peptide sample were enriched using titanium particles and dephosphorylated by immobilized alkaline phosphatase. All adjustment steps of model sample were verified by MALDI LTQ Orbitrap mass spectrometry.
capillary zone electrophoresis, MALDI-MS, phosphopeptides, ?-casein, alkaline phosphatase, trypsin
Rozsah průvodní práce
94
Jazyk
CZ
Anotace
Tato diplomová práce se zabývá optimalizací preanalytické úpravy vzorků pro analýzu fosfopeptidů pomocí kapilární zónové elektroforézy ve spojení s UV detekcí. Jako modelový fosfoprotein, na kterém byly testovány postupy úpravy vzorku, byl vybrán hovězím ?-kasein, který byl štěpen proteolytickým enzymem trypsinem. Fosfopeptidy, obsažené v naštěpeném vzorku, byly obohaceny na titanových částicích a defosforylovány imobilizovanou alkalickou fosfatázou. Všechny kroky úpravy modelového vzorku byly ověřovány pomocí MALDI LTQ Orbitrap hmotnostní spektrometrie.
Anotace v angličtině
This diploma thesis was focused on optimization of sample preparation for the analysis of phosphopeptides using capillary zone electrophoresis in connection with UV detection. All sample preparation steps were tested on bovine ?-casein, which was chosen as a standard phosphoprotein. Sample of ?-casein was digested by the proteolytic enzyme trypsin. Phosphopeptides occurring in the peptide sample were enriched using titanium particles and dephosphorylated by immobilized alkaline phosphatase. All adjustment steps of model sample were verified by MALDI LTQ Orbitrap mass spectrometry.
capillary zone electrophoresis, MALDI-MS, phosphopeptides, ?-casein, alkaline phosphatase, trypsin
Zásady pro vypracování
1. Ve vědecké literatuře vyhledejte práce zabývající se využitím separačních technik v kapalné fázi pro analýzu fosforylovaných proteinů a fosfopeptidů. Při vypracování literární rešerše se zaměřte zejména na preanalytické fáze úpravy vzorků fosfopeptidů, způsoby obohacování vzorků a jejich následnou separaci pomocí kapilární zónové elektroforézy (CZE).
2. Proveďte štěpení modelového fosfoproteinu alfa-kaseinu pomocí proteolytického enzymu trypsinu a optimalizujte postup obohacení získaných fosfopeptidů na TiO2 částicích. Dále optimalizujte postup defosforylace obohacených fosfopeptidů pomocí imobilizované alkalické fosfatázy a proveďte srovnávací CZE separace peptidů před a po defosforylaci.
3. Získané výsledky kriticky zhodnoťte a diskutujte jejich použitelnost a přínos pro analýzu reálných vzorků fosfopeptidů v komplexních směsích proteinů.
Zásady pro vypracování
1. Ve vědecké literatuře vyhledejte práce zabývající se využitím separačních technik v kapalné fázi pro analýzu fosforylovaných proteinů a fosfopeptidů. Při vypracování literární rešerše se zaměřte zejména na preanalytické fáze úpravy vzorků fosfopeptidů, způsoby obohacování vzorků a jejich následnou separaci pomocí kapilární zónové elektroforézy (CZE).
2. Proveďte štěpení modelového fosfoproteinu alfa-kaseinu pomocí proteolytického enzymu trypsinu a optimalizujte postup obohacení získaných fosfopeptidů na TiO2 částicích. Dále optimalizujte postup defosforylace obohacených fosfopeptidů pomocí imobilizované alkalické fosfatázy a proveďte srovnávací CZE separace peptidů před a po defosforylaci.
3. Získané výsledky kriticky zhodnoťte a diskutujte jejich použitelnost a přínos pro analýzu reálných vzorků fosfopeptidů v komplexních směsích proteinů.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího práce.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Diplomantka seznámila členy komise s obsahem a výsledky své diplomové práce, vyslechla si posudek vedoucího a oponenta diplomové práce. Diplomantka zodpověděla dotazy oponenta a členů komise.