Cílem diplomové práce byla analýza interakce proteinu Tomm34 s peptidy Hsp70/Hsp90 metodou H/D výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií.
Dílčími cíli bylo: (1) optimalizovat přípravu vzorku pro H/D výměnu, (2) provést peptidové mapování proteinu Tomm34 a (3) popsat jeho strukturu.
Prvním krokem byla optimalizace přípravy vzorku pro H/D výměnu. Experimentálně bylo stanoveno množství přidávaného glycinu, který byl použit k zastavení H/D výměny tak, aby dané množství zajistilo pokles pH na požadovanou hodnotu. Dalším krokem bylo peptidové mapování proteinu Tomm34 po štěpení na koloně s imobilizovaným pepsinem. Informace o detekovaných peptidech byly použity k vyhledání odpovídajících peptidů v hmotnostních spektrech deuterovaných vzorků. Experiment H/D výměny byl proveden pro samostatný protein Tomm34, pro Tomm34 v komplexu s C-koncovým peptidem Hsp70 a pro Tomm34 v komplexu s C-koncovým peptidem Hsp90.
Získaná data ukázala, že protein Tomm34 interaguje s peptidy Hsp70 i Hsp90. Domény TPR1 a TPR2 proteinu Tomm34 byly specificky chráněny proti výměně amidových vodíků oběma peptidy. Doména TPR1 byla preferenčně chráněná peptidem Hsp70 a doména TPR2 byla preferenčně chráněná peptidem Hsp90.
Annotation in English
The aim of this thesis was to analyze interactions between protein Tomm34 and Hsp70/Hsp90 peptides by H/D exchange coupled to mass spectrometry. Partial aims were to (1) optimize sample preparation for H/D exchange, (2) perform peptide mapping for protein Tomm34 and (3) describe its structure.
The first step was optimization of sample preparation for H/D exchange. Amount of glycin which was used for quenching of H/D exchange by lowering of pH, was determined experimentally. Next step was peptide mapping of Tomm34, which was digest on pepsin column. Informations about detected peptides were used for the founding of peptides in mass spectra obtained by analysis of deuterated samples. H/D exchange was performed for Tomm34, Tomm34 in complex with C-terminal peptide of Hsp70 and Tomm34 in complex with C-terminal peptide of Hsp90. Our data showed that Tomm34 nteracts with peptide of Hsp70 and also with peptide of Hsp90. TPR1 and TPR2 domains of Tomm34 was specifically protected from deuteration by the presence of both peptides. Protection of TPR1 domain was preferentially mediated by Hsp70 while protection of TPR2 was preferentially mediated by Hsp90.
Cílem diplomové práce byla analýza interakce proteinu Tomm34 s peptidy Hsp70/Hsp90 metodou H/D výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií.
Dílčími cíli bylo: (1) optimalizovat přípravu vzorku pro H/D výměnu, (2) provést peptidové mapování proteinu Tomm34 a (3) popsat jeho strukturu.
Prvním krokem byla optimalizace přípravy vzorku pro H/D výměnu. Experimentálně bylo stanoveno množství přidávaného glycinu, který byl použit k zastavení H/D výměny tak, aby dané množství zajistilo pokles pH na požadovanou hodnotu. Dalším krokem bylo peptidové mapování proteinu Tomm34 po štěpení na koloně s imobilizovaným pepsinem. Informace o detekovaných peptidech byly použity k vyhledání odpovídajících peptidů v hmotnostních spektrech deuterovaných vzorků. Experiment H/D výměny byl proveden pro samostatný protein Tomm34, pro Tomm34 v komplexu s C-koncovým peptidem Hsp70 a pro Tomm34 v komplexu s C-koncovým peptidem Hsp90.
Získaná data ukázala, že protein Tomm34 interaguje s peptidy Hsp70 i Hsp90. Domény TPR1 a TPR2 proteinu Tomm34 byly specificky chráněny proti výměně amidových vodíků oběma peptidy. Doména TPR1 byla preferenčně chráněná peptidem Hsp70 a doména TPR2 byla preferenčně chráněná peptidem Hsp90.
Annotation in English
The aim of this thesis was to analyze interactions between protein Tomm34 and Hsp70/Hsp90 peptides by H/D exchange coupled to mass spectrometry. Partial aims were to (1) optimize sample preparation for H/D exchange, (2) perform peptide mapping for protein Tomm34 and (3) describe its structure.
The first step was optimization of sample preparation for H/D exchange. Amount of glycin which was used for quenching of H/D exchange by lowering of pH, was determined experimentally. Next step was peptide mapping of Tomm34, which was digest on pepsin column. Informations about detected peptides were used for the founding of peptides in mass spectra obtained by analysis of deuterated samples. H/D exchange was performed for Tomm34, Tomm34 in complex with C-terminal peptide of Hsp70 and Tomm34 in complex with C-terminal peptide of Hsp90. Our data showed that Tomm34 nteracts with peptide of Hsp70 and also with peptide of Hsp90. TPR1 and TPR2 domains of Tomm34 was specifically protected from deuteration by the presence of both peptides. Protection of TPR1 domain was preferentially mediated by Hsp70 while protection of TPR2 was preferentially mediated by Hsp90.
1) Teoretická část:
a) Přehled metod zabývajících se studiem struktury proteinů
b) Rešerše o metodě H/D výměny spojené s LC MS/MS
c) Rešerše o protein-proteinových interakcích a jejich význam v nádorové onkogenezi
d) Rešerše o Tomm34 proteinu a chaperonech se zaměřením na charakteristiku jejich struktury a funkce
2) Praktická část:
a) Optimalizace přípravy vzorků pro H/D výměnu
b) Peptidové mapování rekombinantního proteinu Tomm34 provedené hmotnostně spektrometrickým měřením
c) Měření kinetiky H/D výměny na hmotnostním spektrometru LC MS/MS
d) Interpretace naměřených dat včetně grafického vyhodnocení
e) Bioinformatická studie, návrh proteinového modelu s označením strukturních změn po interakci proteinu Tomm34 s chaperony Hsp70 a Hsp90
Research Plan
1) Teoretická část:
a) Přehled metod zabývajících se studiem struktury proteinů
b) Rešerše o metodě H/D výměny spojené s LC MS/MS
c) Rešerše o protein-proteinových interakcích a jejich význam v nádorové onkogenezi
d) Rešerše o Tomm34 proteinu a chaperonech se zaměřením na charakteristiku jejich struktury a funkce
2) Praktická část:
a) Optimalizace přípravy vzorků pro H/D výměnu
b) Peptidové mapování rekombinantního proteinu Tomm34 provedené hmotnostně spektrometrickým měřením
c) Měření kinetiky H/D výměny na hmotnostním spektrometru LC MS/MS
d) Interpretace naměřených dat včetně grafického vyhodnocení
e) Bioinformatická studie, návrh proteinového modelu s označením strukturních změn po interakci proteinu Tomm34 s chaperony Hsp70 a Hsp90
Recommended resources
Michael J Chalmers, Scott A Busby, Bruce D Pascal, Graham M West, and Patrick R Griffin: Differential hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry analysis of protein-ligand interactions Expert Review of Proteomics, 2011, 8 (1), 43-59
Kolektiv autorů: Vybrané kapitoly z molekulární patologie. Učební texty Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové. Sv. 357, Brno: Univerzita obrany, 2008
Pierre Faou, Nicholas J. Hoogenraad: Tomm34: A cytosolic cochaperone of the Hsp90/Hsp70 protein complex involved in mitochondrial protein import. Biochimica et Biophysica Acta 1823 (2012) 348-357
Recommended resources
Michael J Chalmers, Scott A Busby, Bruce D Pascal, Graham M West, and Patrick R Griffin: Differential hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry analysis of protein-ligand interactions Expert Review of Proteomics, 2011, 8 (1), 43-59
Kolektiv autorů: Vybrané kapitoly z molekulární patologie. Učební texty Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové. Sv. 357, Brno: Univerzita obrany, 2008
Pierre Faou, Nicholas J. Hoogenraad: Tomm34: A cytosolic cochaperone of the Hsp90/Hsp70 protein complex involved in mitochondrial protein import. Biochimica et Biophysica Acta 1823 (2012) 348-357
Enclosed appendices
CD
Appendices bound in thesis
-
Taken from the library
No
Full text of the thesis
Appendices
Reviewer's report
Supervisor's report
Defence procedure record
1. Prezentace výsledků diplomové práce.
2. Diskuze k posudku vedoucího a oponenta bakalářské práce.
3. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP.