Tato diplomová práce je zaměřena na analýzu fosfoproteinů a zejména fosfopeptidů pomocí vybraných izolačních a obohacovacích technik ve spojení s MALDI-MS s cílem ověřit jejich použitelnost a zavést je do laboratorní praxe.
Teoretická část je věnována problematice Alzheimerovy choroby se zaměřením na tau protein, jeho význam, funkci a důsledky jeho hyperfosforylace v mozkové tkáni. Cílem bylo seznámit čtenáře s důležitostí posttranslačních modifikací se zaměřením na fosforylace.
Experimentální část zahrnuje separaci pomocí gelové elektroforézy, optimalizaci proteolytického štěpení modelových fosfopeptidů v gelu a následnou MALDI-MS analýzu s využitím různých matric. Dále jsou zde zahrnuty různé obohacovací techniky fosfopeptidů: IMAC, využití TiO2 částic a SIMAC a další techniky derivatizace peptidů pomocí SPITC pro de novo sekvenaci peptidů za účasti exopeptidáz.
Uvedené metody a získané poznatky mají potenciál pro využití při studiu a diagnostice Alzheimerovy choroby.
Annotation in English
This thesis is focused on the analysis of phosphoproteins and phosphopeptides using especially selected isolation and enrichment techniques in conjunction with MALDI-MS to verify their applicability and introduce them into laboratory praxis.
The theoretical part is dedicated to the problematics of Alzheimer's disease with a focus on tau protein, its importance, and the consequences of hyperphosphorylation in brain tissue. The aim was to familiarize the reader with the importance of post-translational modifications, focusing on phosphorylation.
Experimental part includes the separation using gel electrophoresis, optimization of proteolytic cleavage of model phosphopeptides, followed by MALDI-MS analysis using different matrices. There are also included various enrichment techniques of phosphopeptides: IMAC, application of TiO2 particles and SIMAC and also other techniques for detivatization of peptides by SPITC for de novo sequencing and de novo sequencing with the participation of exopeptidases.
These methods and the obtained experience have the potential to be used during the study and diagnostics of Alzheimer's disease.
Keywords
Alzheimerova choroba, fosfopeptid, fosfoprotein, IMAC, TiO2, SIMAC, hmotnostní spektrometrie, de novo sekvenace
Keywords in English
Alzheimer´s disease, phosphopeptide, phoshoprotein, IMAC, TiO2, SIMAC mass spectrometry, de novo sequencing
Length of the covering note
-
Language
CZ
Annotation
Tato diplomová práce je zaměřena na analýzu fosfoproteinů a zejména fosfopeptidů pomocí vybraných izolačních a obohacovacích technik ve spojení s MALDI-MS s cílem ověřit jejich použitelnost a zavést je do laboratorní praxe.
Teoretická část je věnována problematice Alzheimerovy choroby se zaměřením na tau protein, jeho význam, funkci a důsledky jeho hyperfosforylace v mozkové tkáni. Cílem bylo seznámit čtenáře s důležitostí posttranslačních modifikací se zaměřením na fosforylace.
Experimentální část zahrnuje separaci pomocí gelové elektroforézy, optimalizaci proteolytického štěpení modelových fosfopeptidů v gelu a následnou MALDI-MS analýzu s využitím různých matric. Dále jsou zde zahrnuty různé obohacovací techniky fosfopeptidů: IMAC, využití TiO2 částic a SIMAC a další techniky derivatizace peptidů pomocí SPITC pro de novo sekvenaci peptidů za účasti exopeptidáz.
Uvedené metody a získané poznatky mají potenciál pro využití při studiu a diagnostice Alzheimerovy choroby.
Annotation in English
This thesis is focused on the analysis of phosphoproteins and phosphopeptides using especially selected isolation and enrichment techniques in conjunction with MALDI-MS to verify their applicability and introduce them into laboratory praxis.
The theoretical part is dedicated to the problematics of Alzheimer's disease with a focus on tau protein, its importance, and the consequences of hyperphosphorylation in brain tissue. The aim was to familiarize the reader with the importance of post-translational modifications, focusing on phosphorylation.
Experimental part includes the separation using gel electrophoresis, optimization of proteolytic cleavage of model phosphopeptides, followed by MALDI-MS analysis using different matrices. There are also included various enrichment techniques of phosphopeptides: IMAC, application of TiO2 particles and SIMAC and also other techniques for detivatization of peptides by SPITC for de novo sequencing and de novo sequencing with the participation of exopeptidases.
These methods and the obtained experience have the potential to be used during the study and diagnostics of Alzheimer's disease.
Keywords
Alzheimerova choroba, fosfopeptid, fosfoprotein, IMAC, TiO2, SIMAC, hmotnostní spektrometrie, de novo sekvenace
Keywords in English
Alzheimer´s disease, phosphopeptide, phoshoprotein, IMAC, TiO2, SIMAC mass spectrometry, de novo sequencing
Research Plan
Cílem práce je zavedení technik využitelných pro analýzu struktury fosforylovaného Tau proteinu pomocí exopeptidáz a derivatizačních kroků pro analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie. Součástí bude i 1) optimalizace podmínek obohacovacích technik pro izolaci fosforylovaných proteinů 2) krok derivatizace peptidů pro de novo sekvenace proteinů 3) optimalizace složení matrice pro MS analýzu, 4) technika sekevenování de novo spolu s účastí exopeptidáz.
Teoretická část bude obsahovat:
1) Význam a funkce PTM pro proteiny s důrazem na fosforylace
2) Přehled všech recentních obohacovacích a purifikačních technik umožňujících získat proteiny pro strukturní analýzu
3) Techniky hmotnostní spektrometrie pro strukturní analýzu proteinů
4) Tau protein - jeden z významných markerů Alzheimerovy choroby
5) Pro teoretickou rešerši využít nejnovější literární zdroje
Experimentální část bude obsahovat dílčí kroky:
1) Elektroforetické separace modelových fosfoproteinů, digesce v gelu pro následnou MS identifikaci a strukturní analýzu proteinů
2) Obohacovací techniky pro fosfoproteiny (IMAC, TiO2, SIMAC) - vsádkové uspořádání
3) Optimalizace složení matrice pro MS analýzu fosfoproteinů
4) Derivatizace peptidů pomocí SPITC pro de novo sekvenace
5) Technika de novo sekvenování za účasti exopeptidáz a určování fosforylovaných aminokyselin
Research Plan
Cílem práce je zavedení technik využitelných pro analýzu struktury fosforylovaného Tau proteinu pomocí exopeptidáz a derivatizačních kroků pro analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie. Součástí bude i 1) optimalizace podmínek obohacovacích technik pro izolaci fosforylovaných proteinů 2) krok derivatizace peptidů pro de novo sekvenace proteinů 3) optimalizace složení matrice pro MS analýzu, 4) technika sekevenování de novo spolu s účastí exopeptidáz.
Teoretická část bude obsahovat:
1) Význam a funkce PTM pro proteiny s důrazem na fosforylace
2) Přehled všech recentních obohacovacích a purifikačních technik umožňujících získat proteiny pro strukturní analýzu
3) Techniky hmotnostní spektrometrie pro strukturní analýzu proteinů
4) Tau protein - jeden z významných markerů Alzheimerovy choroby
5) Pro teoretickou rešerši využít nejnovější literární zdroje
Experimentální část bude obsahovat dílčí kroky:
1) Elektroforetické separace modelových fosfoproteinů, digesce v gelu pro následnou MS identifikaci a strukturní analýzu proteinů
2) Obohacovací techniky pro fosfoproteiny (IMAC, TiO2, SIMAC) - vsádkové uspořádání
3) Optimalizace složení matrice pro MS analýzu fosfoproteinů
4) Derivatizace peptidů pomocí SPITC pro de novo sekvenace
5) Technika de novo sekvenování za účasti exopeptidáz a určování fosforylovaných aminokyselin
Recommended resources
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Recommended resources
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Enclosed appendices
-
Appendices bound in thesis
-
Taken from the library
No
Full text of the thesis
Appendices
Reviewer's report
Supervisor's report
Defence procedure record
1. Prezentace výsledků diplomové práce.
2. Přečtení posudků vedoucího a oponenta diplomové práce.
3. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce.
4. Studentka odpovídala na všechny dotazy a připomínky k DP.