Předložená diplomová práce se zabývá technikami úpravy proteomického vzorku pro snadnější interpretaci tandemových hmotnostních spekter za účelem de novo sekvenace proteinů. V experimentální části byly provedeny modifikační reakce tryptických peptidů myoglobinu. Na stacionární fázi v kolonce (s následující separací) byly provedeny reakce s O-methylisomočovinou a 4-sulfofenylisothiokyanátem, dále dimethylace formaldehydem (lehkým a deuterovaným). V roztoku byla provedena reakce
s 4-chlorosulfofenylisothiokyanátem a esterifikace peptidických karboxylů ethanolem. Jako efektivní metody se ukázaly být oba typy modifikačních reakcí prováděných na kolonce. Modifikace O-methylisomočovinou a 4-sulfofenylisothiokyanátem poskytovala přehledná fragmentační spektra obsahující y-ionty, což spolu s protokolem pro aplikaci obohacení peptidů obsahujících sulfonové skupiny usnadňuje hmotnostně spektrometrickou analýzu složitějších směsí. Podobně dimethylace peptidů pomocí formaldehydu po jejich předchozí guadinylaci umožnila identifikovat N-terminální ionty pomocí dvojic píků s konstantním rozdílem a usnadnit tak interpretaci MS/MS spekter peptidů.
Anotace v angličtině
Presented diploma thesis deals with sample modification techniques for facilitated interpretation of tandem mass spectra during de novo sequencing of proteins. In the experimental part, the modification reactions of tryptic peptides from equine myoglobin were carried out. Modification with O-methylisourea hemisulfate, sodium
4-sulfophenylisothiocyanate and dimethylation with light and heavy formaldehyde were carried out on the stationary phase inside a chromatography column with the optional following separation of modified peptides. Modifications with
4-chlorosulfophenylisocyanate and esterification of peptide carboxyl groups with ethanol were carried out on the stationary phase dispensed in solution. Modification with
O-methylisourea hemisulfate and sodium 4-sulfophenylisothicyanate yielded with MS/MS spectrum only with y-ions, which facilitates mass spectrometry analysis of more complex samples especially in combination with a protocol for enrichment of peptides containing sulfonic group. Similarly, peptide dimethylation with formaldehyde after preceding guanidylation reaction, enabled also identification of N-terminal ions due to the presences of peak pairs showing a constant difference and thus facilitated interpretation of MS/MS spectrum of fragmented peptides.
Klíčová slova
De novo sekvenace, chemická derivatizace, hmotnostní spektrometrie,
MALDI-TOF/TOF MS
Klíčová slova v angličtině
De novo sequencing, chemical derivatization, mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF MS
Rozsah průvodní práce
93 s (128171 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
Předložená diplomová práce se zabývá technikami úpravy proteomického vzorku pro snadnější interpretaci tandemových hmotnostních spekter za účelem de novo sekvenace proteinů. V experimentální části byly provedeny modifikační reakce tryptických peptidů myoglobinu. Na stacionární fázi v kolonce (s následující separací) byly provedeny reakce s O-methylisomočovinou a 4-sulfofenylisothiokyanátem, dále dimethylace formaldehydem (lehkým a deuterovaným). V roztoku byla provedena reakce
s 4-chlorosulfofenylisothiokyanátem a esterifikace peptidických karboxylů ethanolem. Jako efektivní metody se ukázaly být oba typy modifikačních reakcí prováděných na kolonce. Modifikace O-methylisomočovinou a 4-sulfofenylisothiokyanátem poskytovala přehledná fragmentační spektra obsahující y-ionty, což spolu s protokolem pro aplikaci obohacení peptidů obsahujících sulfonové skupiny usnadňuje hmotnostně spektrometrickou analýzu složitějších směsí. Podobně dimethylace peptidů pomocí formaldehydu po jejich předchozí guadinylaci umožnila identifikovat N-terminální ionty pomocí dvojic píků s konstantním rozdílem a usnadnit tak interpretaci MS/MS spekter peptidů.
Anotace v angličtině
Presented diploma thesis deals with sample modification techniques for facilitated interpretation of tandem mass spectra during de novo sequencing of proteins. In the experimental part, the modification reactions of tryptic peptides from equine myoglobin were carried out. Modification with O-methylisourea hemisulfate, sodium
4-sulfophenylisothiocyanate and dimethylation with light and heavy formaldehyde were carried out on the stationary phase inside a chromatography column with the optional following separation of modified peptides. Modifications with
4-chlorosulfophenylisocyanate and esterification of peptide carboxyl groups with ethanol were carried out on the stationary phase dispensed in solution. Modification with
O-methylisourea hemisulfate and sodium 4-sulfophenylisothicyanate yielded with MS/MS spectrum only with y-ions, which facilitates mass spectrometry analysis of more complex samples especially in combination with a protocol for enrichment of peptides containing sulfonic group. Similarly, peptide dimethylation with formaldehyde after preceding guanidylation reaction, enabled also identification of N-terminal ions due to the presences of peak pairs showing a constant difference and thus facilitated interpretation of MS/MS spectrum of fragmented peptides.
Klíčová slova
De novo sekvenace, chemická derivatizace, hmotnostní spektrometrie,
MALDI-TOF/TOF MS
Klíčová slova v angličtině
De novo sequencing, chemical derivatization, mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF MS
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Proteomická analýza - její cíle a metody.
Základní hmotnostně-spektrometrické techniky pro analýzu peptidů a proteinů.
De-novo sekvenace peptidů - důvody, způsoby a využití.
Metody derivatizace peptidů - porovnání, výhody a limitace.
Experimentální část:
Příprava modelové směsi tryptických peptidů myoglobinu jako standardního vzorku pro optimalizaci derivatizační metody.
Separace peptidů na kapilárních kolonkách s reverzní fází pomocí mikrogradientového zařízení.
Derivatizace peptidů zachycených na kolonce pomocí vybraných činidel s následnou separací vzorků a hmotnostně-spektrometrickou analýzou.
Optimalizace reakčních podmínek na stacionární fázi.
Vyhodnocení získaných experimentálních dat a jejich interpretace.
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Proteomická analýza - její cíle a metody.
Základní hmotnostně-spektrometrické techniky pro analýzu peptidů a proteinů.
De-novo sekvenace peptidů - důvody, způsoby a využití.
Metody derivatizace peptidů - porovnání, výhody a limitace.
Experimentální část:
Příprava modelové směsi tryptických peptidů myoglobinu jako standardního vzorku pro optimalizaci derivatizační metody.
Separace peptidů na kapilárních kolonkách s reverzní fází pomocí mikrogradientového zařízení.
Derivatizace peptidů zachycených na kolonce pomocí vybraných činidel s následnou separací vzorků a hmotnostně-spektrometrickou analýzou.
Optimalizace reakčních podmínek na stacionární fázi.
Vyhodnocení získaných experimentálních dat a jejich interpretace.
Seznam doporučené literatury
Recentní odborná literatura dle pokynů vedoucího diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Recentní odborná literatura dle pokynů vedoucího diplomové práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1) Prezentace výsledků diplomové práce. 2) Diskuze k posudku vedoucího a oponenta diplomové práce. 3) Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP.