Užíváním mnoha druhů léku, a vystavováním našeho těla účinkům xenobiotik vůbec, zatěžujeme tělo pochody, kterými se snaží tyto látky odbourat. Dané xenobiotikum je v organismu metabolizováno pomocí I. a II. fáze biotransformace. Cytochromy P450 patří mezi nejdůležitější detoxikační enzymy I. fáze biotransformace xenobiotik v lidském organismu. Tyto hemoproteiny se tak uplatňují společně s II. fází biotransformace na eliminaci xenobiotik z buněk a jejich celkovém odstranění z organismu.
Hlavním cílem mé práce bylo optimalizovat metodický postup stanovení aktivity cytochromu 1A2 pomocí metody spektrofotometrické, spektrofluorimetrické a pomocí HPLC s UV/VIS detekcí u různých buněčných linií. Zjistili jsme, že spektrofotometrická metoda není z důvodu malé senzitivity vhodná. U metody HPLC-UV/VIS se nám také z hlediska nízké citlivosti detekce nedokázalo detekovat aktivitu CYP 1A2. Proto jsme jako nejvhodnější metodu určili metodu spektrofluorimetrickou s dobou měření aktivity v délce 1 hod.
Optimalizované postupy jsme použili při analýze vzorků biologického materiálu, tj. buněčnou linii pocházející z lidských buněk hepatocytárního karcinomu HepG2, linii lidských epiteliálních ledvinných buněk proximálního tubulu HK-2 a buněčnou linii lidského plicního adenokarcinomu A549. U všech tří linií jsme se zaměřili na stanovení aktivity CYP 1A2. Až na buněčnou linii HK-2 se nám podařilo spektrofluorimetricky detekovat aktivitu CYP 1A2. S ohledem na to lze závěrem říci, že jsme zavedli a optimalizovali spektrofluorimetrickou metodu ke stanovení aktivity CYP 1A2 v podmínkách in vitro.
Anotace v angličtině
Our organism has to metabolize a number of drugs and xenobiotics which might impair its function. The xenobiotics are metabolized through two phases of biotransformation phase I and phase II. Cytochromes P450 are likely the most important detoxification enzymes participating in phase I of xenobiotic biotransformation in human organism. These hemoproteins play an important role together with phase II processes in the elimination of xenobiotics from cells and in their total removal from the body.
The main aim of my work was the optimization of a methodological approach for determination of cytochrome 1A2 activity using spectrophotometric, spectrofluorimetric methods and HPLC with UV/VIS detection in cell lines. We have found that spectrophotometric method is not suitable because of the low detection limit. In addition, we did not detect CYP 1A2 activity using HPLC-UV/VIS due to low sensitivity. Finally, we have determined the spectrofluorimetric assay as the most suitable method with 1 h duration of measurement.
We used the optimized procedures of sample preparation for analysis of CYP activity in a biological material - human hepatocellular cell line HepG2, proximal tubular epithelial renal cell line HK-2 and human lung adenocarcinoma cell line A549. We focused on determination of CYP 1A2 activity in all three cell lines. Except of HK-2 cells, we were able to detect CYP 1A2 activity in both other cell lines fluorimetrically. In conclusion, we introduced and optimized the spectrofluorimetric method to determine CYP 1A2 activity in vitro.
CYP450, biotransformation of xenobiotics, CYP 1A2, fluorometry
Rozsah průvodní práce
74 s.
Jazyk
CZ
Anotace
Užíváním mnoha druhů léku, a vystavováním našeho těla účinkům xenobiotik vůbec, zatěžujeme tělo pochody, kterými se snaží tyto látky odbourat. Dané xenobiotikum je v organismu metabolizováno pomocí I. a II. fáze biotransformace. Cytochromy P450 patří mezi nejdůležitější detoxikační enzymy I. fáze biotransformace xenobiotik v lidském organismu. Tyto hemoproteiny se tak uplatňují společně s II. fází biotransformace na eliminaci xenobiotik z buněk a jejich celkovém odstranění z organismu.
Hlavním cílem mé práce bylo optimalizovat metodický postup stanovení aktivity cytochromu 1A2 pomocí metody spektrofotometrické, spektrofluorimetrické a pomocí HPLC s UV/VIS detekcí u různých buněčných linií. Zjistili jsme, že spektrofotometrická metoda není z důvodu malé senzitivity vhodná. U metody HPLC-UV/VIS se nám také z hlediska nízké citlivosti detekce nedokázalo detekovat aktivitu CYP 1A2. Proto jsme jako nejvhodnější metodu určili metodu spektrofluorimetrickou s dobou měření aktivity v délce 1 hod.
Optimalizované postupy jsme použili při analýze vzorků biologického materiálu, tj. buněčnou linii pocházející z lidských buněk hepatocytárního karcinomu HepG2, linii lidských epiteliálních ledvinných buněk proximálního tubulu HK-2 a buněčnou linii lidského plicního adenokarcinomu A549. U všech tří linií jsme se zaměřili na stanovení aktivity CYP 1A2. Až na buněčnou linii HK-2 se nám podařilo spektrofluorimetricky detekovat aktivitu CYP 1A2. S ohledem na to lze závěrem říci, že jsme zavedli a optimalizovali spektrofluorimetrickou metodu ke stanovení aktivity CYP 1A2 v podmínkách in vitro.
Anotace v angličtině
Our organism has to metabolize a number of drugs and xenobiotics which might impair its function. The xenobiotics are metabolized through two phases of biotransformation phase I and phase II. Cytochromes P450 are likely the most important detoxification enzymes participating in phase I of xenobiotic biotransformation in human organism. These hemoproteins play an important role together with phase II processes in the elimination of xenobiotics from cells and in their total removal from the body.
The main aim of my work was the optimization of a methodological approach for determination of cytochrome 1A2 activity using spectrophotometric, spectrofluorimetric methods and HPLC with UV/VIS detection in cell lines. We have found that spectrophotometric method is not suitable because of the low detection limit. In addition, we did not detect CYP 1A2 activity using HPLC-UV/VIS due to low sensitivity. Finally, we have determined the spectrofluorimetric assay as the most suitable method with 1 h duration of measurement.
We used the optimized procedures of sample preparation for analysis of CYP activity in a biological material - human hepatocellular cell line HepG2, proximal tubular epithelial renal cell line HK-2 and human lung adenocarcinoma cell line A549. We focused on determination of CYP 1A2 activity in all three cell lines. Except of HK-2 cells, we were able to detect CYP 1A2 activity in both other cell lines fluorimetrically. In conclusion, we introduced and optimized the spectrofluorimetric method to determine CYP 1A2 activity in vitro.
CYP450, biotransformation of xenobiotics, CYP 1A2, fluorometry
Zásady pro vypracování
1.) Zpracujte literární rešerši zaměřenou na metabolismus xenobiotik u člověka, jeho jednotlivé fáze, typy buněčných cytochromů, apod. Jmenovitě se zaměřte na uvedení a rozdělení typů CYP, obecný princip oxidačně/redukčních mikrosomálních reakcí, popř. také význam pro daná léčiva, jež jsou danými enzymy metabolizována. Dále detailně popište funkci, výskyt a možnosti stanovení izoenzymů CYP 2E1, 1A2 a 3A4. Ke zpracování tohoto přehledu využijte elektronické databáze (ScienceDirect, NCBI Pubmed, Web of Science).
2.) V rámci praktické části: 1) optimalizujte stanovení intracelulární aktivity minimálně jednoho z izoenzymů cytochromu P450 2E1, 1A2 nebo 3A4; 2) optimalizujte přípravu biologického materiálu pro stanovení aktivity daného CYP; 3) zavedenou metodu, popř. více metod (HPLC/UV/FL/MS nebo spektrofluorimetrické metody) využijte ke stanovení aktivity CYP v daných buňkách.
3.) Získaná experimentální data statisticky zpracujte a diskutujte. Své výsledky následně porovnejte s výstupy jiných autorů.
Zásady pro vypracování
1.) Zpracujte literární rešerši zaměřenou na metabolismus xenobiotik u člověka, jeho jednotlivé fáze, typy buněčných cytochromů, apod. Jmenovitě se zaměřte na uvedení a rozdělení typů CYP, obecný princip oxidačně/redukčních mikrosomálních reakcí, popř. také význam pro daná léčiva, jež jsou danými enzymy metabolizována. Dále detailně popište funkci, výskyt a možnosti stanovení izoenzymů CYP 2E1, 1A2 a 3A4. Ke zpracování tohoto přehledu využijte elektronické databáze (ScienceDirect, NCBI Pubmed, Web of Science).
2.) V rámci praktické části: 1) optimalizujte stanovení intracelulární aktivity minimálně jednoho z izoenzymů cytochromu P450 2E1, 1A2 nebo 3A4; 2) optimalizujte přípravu biologického materiálu pro stanovení aktivity daného CYP; 3) zavedenou metodu, popř. více metod (HPLC/UV/FL/MS nebo spektrofluorimetrické metody) využijte ke stanovení aktivity CYP v daných buňkách.
3.) Získaná experimentální data statisticky zpracujte a diskutujte. Své výsledky následně porovnejte s výstupy jiných autorů.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce.
2. Diskuze k posudku vedoucího a oponenta diplomové práce.
3. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP.