Táto diplomová práca je zameraná na zavedenie systému izolácie exozómov, pomocou ktorej by bolo možné detegovať tieto EVs z ľudskej krvi. Tento Systém je založený na kombinácii imunoanalýzy magnetickej separácie na báze imunoprecipitácie a imunochemickej detekcie vyizolovaných exozómov komerčným izolačným kitom. Princíp separácie spočíva v reakcii antigénu v podobe povrchových proteínov na exozómoch so špecifickými monoklonálnými a polyklonálnymi protilátkami imobilizovanými na komerčných magnetických časticiach namierených proti týmto exozomálnym proteínom. Prítomnosť exozómov vo vzorkách séra je detegovaná metódou Semi-Dry Western blot pomocou sekundárnych protilátok značených chrenovou peroxidázou (HRP) pre chemiluminiscenčnú detekciu po predchádzajúcom rozdelení proteínov SDS-PAGE analýzou. Konečným overením prítomnosti exozómov vo vyizolovanej frakcii je hmotnostná analýza po proteolytickom naštepení proteínov z gélu modifikovaným trypsínom.
Anotace v angličtině
This diploma thesis is focused on the introduction of a system of isolation of exosomes, which could be used to detect these EVs from human blood. This system is based on a combination of magnetic separation immunoassay based on immunoprecipitation and immunochemical detection of isolated exosomes with a commercial isolation kit. The principle of separation is the reaction of antigen in the form of surface proteins on exosomes with specific monoclonal and polyclonal antibodies immobilized on commercial magnetic particles directed against these exosomal proteins. The presence of exosomes in serum samples is detected by Semi-Dry Western blot using horseradish peroxidase (HRP) labeled secondary antibodies for chemiluminescent detection after pre-separation of the proteins by SDS-PAGE analysis. The final verification of the presence of exosomes in the isolated fraction is the mass analysis after proteolytic digestion of the proteins from the gel with modified trypsin.
Klíčová slova
Exozómy, extracelulárne vezikuly, imunoprecipitácia, magnetické častice, polyklonálne a monoklonálne protilátky, SDS-PAGE, Semi-Dry Western blot analýza, ľudské sérum
Klíčová slova v angličtině
Exosome, extracellular vesicles, imunoprecipitation, magnetic beads, polyclonal and monoclonal antibody, SDS-PAGE, Semi-Dry Western blot analysis, human serum
Rozsah průvodní práce
120 s.
Jazyk
SK
Anotace
Táto diplomová práca je zameraná na zavedenie systému izolácie exozómov, pomocou ktorej by bolo možné detegovať tieto EVs z ľudskej krvi. Tento Systém je založený na kombinácii imunoanalýzy magnetickej separácie na báze imunoprecipitácie a imunochemickej detekcie vyizolovaných exozómov komerčným izolačným kitom. Princíp separácie spočíva v reakcii antigénu v podobe povrchových proteínov na exozómoch so špecifickými monoklonálnými a polyklonálnymi protilátkami imobilizovanými na komerčných magnetických časticiach namierených proti týmto exozomálnym proteínom. Prítomnosť exozómov vo vzorkách séra je detegovaná metódou Semi-Dry Western blot pomocou sekundárnych protilátok značených chrenovou peroxidázou (HRP) pre chemiluminiscenčnú detekciu po predchádzajúcom rozdelení proteínov SDS-PAGE analýzou. Konečným overením prítomnosti exozómov vo vyizolovanej frakcii je hmotnostná analýza po proteolytickom naštepení proteínov z gélu modifikovaným trypsínom.
Anotace v angličtině
This diploma thesis is focused on the introduction of a system of isolation of exosomes, which could be used to detect these EVs from human blood. This system is based on a combination of magnetic separation immunoassay based on immunoprecipitation and immunochemical detection of isolated exosomes with a commercial isolation kit. The principle of separation is the reaction of antigen in the form of surface proteins on exosomes with specific monoclonal and polyclonal antibodies immobilized on commercial magnetic particles directed against these exosomal proteins. The presence of exosomes in serum samples is detected by Semi-Dry Western blot using horseradish peroxidase (HRP) labeled secondary antibodies for chemiluminescent detection after pre-separation of the proteins by SDS-PAGE analysis. The final verification of the presence of exosomes in the isolated fraction is the mass analysis after proteolytic digestion of the proteins from the gel with modified trypsin.
Klíčová slova
Exozómy, extracelulárne vezikuly, imunoprecipitácia, magnetické častice, polyklonálne a monoklonálne protilátky, SDS-PAGE, Semi-Dry Western blot analýza, ľudské sérum
Klíčová slova v angličtině
Exosome, extracellular vesicles, imunoprecipitation, magnetic beads, polyclonal and monoclonal antibody, SDS-PAGE, Semi-Dry Western blot analysis, human serum
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
V teoretické části diplomové práce stručně popište strukturu a funkci exozómů, shrňte dostupné informace o roli exozómů u mnohobuněčných organismů s důrazem na znalosti o funkci exozómů u vyšších savců. Dále popište varianty mezibuněčné komunikace a molekuly účastnící se těchto dějů. Zjistěte a stručně popište, zda exozómy mají vliv na patofyziologii nádorových onemocnění. Zaměřte se na možnosti využití nádorově specifických exozómu v diagnostice nádorových onemocnění. Dále v práci popište současné metody izolace a charakterizace těchto extracelulárních váčků, včetně popisu v současné době na trhu dostupných komerčních testů. Uveďte praktické příklady jejich použití s důrazem na přednosti a negativa těchto principiálně se lišících metodických postupů.
Experimentální část:
V rámci experimentální části se seznamte a prakticky si vyzkoušejte metodu elektroforetické separace proteinů (SDS-PAGE), techniku western-blot s imunodetekcí pro ověření účinnosti izolace exozómů, 1D elektroforézu pro kontrolu eluentů. Naučte se práci s magnetickými částicemi, seznamte se s principy magnetické separace, vyzkoušejte si metody kovalentní vazby IgG na povrch magnetických částic. Elektroforeticky si ověřte účinnosti vazby a výsledky vyhodnoťte. Nosič použijte k izolaci exozómů z biologického materiálu. Vyzkoušejte si min. tři postupy izolace exozómů pomocí komerčně nabízených diagnostických setů. Porovnejte klady a zápory metod a porovnejte výtěžnost zavedené metody a čistotu výsledného produktu s výsledky získanými pomocí komerčních kitů.
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
V teoretické části diplomové práce stručně popište strukturu a funkci exozómů, shrňte dostupné informace o roli exozómů u mnohobuněčných organismů s důrazem na znalosti o funkci exozómů u vyšších savců. Dále popište varianty mezibuněčné komunikace a molekuly účastnící se těchto dějů. Zjistěte a stručně popište, zda exozómy mají vliv na patofyziologii nádorových onemocnění. Zaměřte se na možnosti využití nádorově specifických exozómu v diagnostice nádorových onemocnění. Dále v práci popište současné metody izolace a charakterizace těchto extracelulárních váčků, včetně popisu v současné době na trhu dostupných komerčních testů. Uveďte praktické příklady jejich použití s důrazem na přednosti a negativa těchto principiálně se lišících metodických postupů.
Experimentální část:
V rámci experimentální části se seznamte a prakticky si vyzkoušejte metodu elektroforetické separace proteinů (SDS-PAGE), techniku western-blot s imunodetekcí pro ověření účinnosti izolace exozómů, 1D elektroforézu pro kontrolu eluentů. Naučte se práci s magnetickými částicemi, seznamte se s principy magnetické separace, vyzkoušejte si metody kovalentní vazby IgG na povrch magnetických částic. Elektroforeticky si ověřte účinnosti vazby a výsledky vyhodnoťte. Nosič použijte k izolaci exozómů z biologického materiálu. Vyzkoušejte si min. tři postupy izolace exozómů pomocí komerčně nabízených diagnostických setů. Porovnejte klady a zápory metod a porovnejte výtěžnost zavedené metody a čistotu výsledného produktu s výsledky získanými pomocí komerčních kitů.
Seznam doporučené literatury
-
Seznam doporučené literatury
-
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce.
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce.
3. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k diplomové práci.