Tato diplomová práce se zabývá relativní kvantifikací proteinů s využitím stabilních izotopových značek ve vzorcích lidské plazmy pacientů s dilatační kardiomyopatií. Experimentální část práce představuje komparativní proteomickou analýzu zahrnující přípravu proteomického vzorku k analýze - deplece abundantních proteinů, denaturace, redukce, alkylace a acetonová precipitace, tryptické štěpení a značení vzorků izobarickými TMT-sixplex značkami. Takto připravené vzorky byly podrobeny frakcionaci, která byla provedena třemi různými chromatografickými technikami, a to v manuálním uspořádání využívající plynotěsnou mikrostříkačku a příslušnou kapilární kolonku. Kromě již zavedených technik manuální frakcionace peptidů na reverzní fázi v bazickém prostředí a hydrofilní interakční chromatografie byla optimalizována třetí frakcionační technika - iontoměničová chromatografie na silném katexu. Získané frakce byly proměřeny nejprve pomocí LC-UV a následně LC-MS/MS analýzy. K bioinformatickému zpracování dat byl využit software Proteome Discoverer. Některé proteiny s identifikovanou změnou zastoupení mezi analyzovanými skupinami byly popsány.
Anotace v angličtině
This diploma thesis deals with the relative quantification of proteins using stable isotope labeling in human plasma samples in patients with dilated cardiomyopathy. The experimental part presents a comparative proteomics analysis including preparation of a proteomic sample for analysis (depletion of abundant proteins, denaturation, reduction, alkylation and acetone precipitation), tryptic digestion and labeling of samples with TMT-sixplex labels. Prepared samples were fractionated by three different chromatographic techniques, in an manual arrangement using a gastight microsyringe with a suitable capillary column. In addition to the already
established techniques of manual fractionation of peptides on the reverse phase in a basic environment and hydrophilic interaction chromatography, the third fractionation technique - strong exchange chromatography was optimized. The obtained fractions were measured first by LC-UV and subsequently by LC-MS/MS analysis. Proteome Discoverer software was used for bioinformatics data postprocessing. Several proteins with identified abundance changes between the analyzed groups were reported.
Manual fractionation, TMT-sixplex, SCX, mass spectrometry, bioinformatics
Rozsah průvodní práce
102 s. (142 136 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
Tato diplomová práce se zabývá relativní kvantifikací proteinů s využitím stabilních izotopových značek ve vzorcích lidské plazmy pacientů s dilatační kardiomyopatií. Experimentální část práce představuje komparativní proteomickou analýzu zahrnující přípravu proteomického vzorku k analýze - deplece abundantních proteinů, denaturace, redukce, alkylace a acetonová precipitace, tryptické štěpení a značení vzorků izobarickými TMT-sixplex značkami. Takto připravené vzorky byly podrobeny frakcionaci, která byla provedena třemi různými chromatografickými technikami, a to v manuálním uspořádání využívající plynotěsnou mikrostříkačku a příslušnou kapilární kolonku. Kromě již zavedených technik manuální frakcionace peptidů na reverzní fázi v bazickém prostředí a hydrofilní interakční chromatografie byla optimalizována třetí frakcionační technika - iontoměničová chromatografie na silném katexu. Získané frakce byly proměřeny nejprve pomocí LC-UV a následně LC-MS/MS analýzy. K bioinformatickému zpracování dat byl využit software Proteome Discoverer. Některé proteiny s identifikovanou změnou zastoupení mezi analyzovanými skupinami byly popsány.
Anotace v angličtině
This diploma thesis deals with the relative quantification of proteins using stable isotope labeling in human plasma samples in patients with dilated cardiomyopathy. The experimental part presents a comparative proteomics analysis including preparation of a proteomic sample for analysis (depletion of abundant proteins, denaturation, reduction, alkylation and acetone precipitation), tryptic digestion and labeling of samples with TMT-sixplex labels. Prepared samples were fractionated by three different chromatographic techniques, in an manual arrangement using a gastight microsyringe with a suitable capillary column. In addition to the already
established techniques of manual fractionation of peptides on the reverse phase in a basic environment and hydrophilic interaction chromatography, the third fractionation technique - strong exchange chromatography was optimized. The obtained fractions were measured first by LC-UV and subsequently by LC-MS/MS analysis. Proteome Discoverer software was used for bioinformatics data postprocessing. Several proteins with identified abundance changes between the analyzed groups were reported.
Manual fractionation, TMT-sixplex, SCX, mass spectrometry, bioinformatics
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
1) Stručný popis metod analýzy proteinů s využitím separačních technik a hmotnostní spektrometrie
2) Přehled metod chromatografické frakcionace peptidů před vlastní LC-MS analýzou
3) Srdeční choroby a jejich proteomická analýza
4) Přehled metod pro kvantifikace proteinů v klinicky relevantních vzorcích
5) Principy značení proteinových a peptidových vzorků pomocí stabilních izotopových značek
6) Přehled softwarových nástrojů používaných pro kvantitativní proteomickou analýzu
Experimentální část:
Příprava vzorků pro analýzu - úprava proteinového vzorku a tryptické štěpení proteinů
Příprava kapilárních kolonek s vhodnou chromatografickou fází (reverzní fáze, HILIC, SCX) pro frakcionaci a odsolení peptidických vzorků
Značení peptidů stabilními izotopovými značkami
Chromatografická purifikace nebo frakcionace peptidů mikrogradientovým zařízením
Optimalizace chromatografické frakcionace peptidů mikrogradientovým zařízením na SCX fázi
Analýza peptidických vzorků pomocí kombinace kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie
Vyhodnocení získaných experimentálních dat a jejich interpretace
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
1) Stručný popis metod analýzy proteinů s využitím separačních technik a hmotnostní spektrometrie
2) Přehled metod chromatografické frakcionace peptidů před vlastní LC-MS analýzou
3) Srdeční choroby a jejich proteomická analýza
4) Přehled metod pro kvantifikace proteinů v klinicky relevantních vzorcích
5) Principy značení proteinových a peptidových vzorků pomocí stabilních izotopových značek
6) Přehled softwarových nástrojů používaných pro kvantitativní proteomickou analýzu
Experimentální část:
Příprava vzorků pro analýzu - úprava proteinového vzorku a tryptické štěpení proteinů
Příprava kapilárních kolonek s vhodnou chromatografickou fází (reverzní fáze, HILIC, SCX) pro frakcionaci a odsolení peptidických vzorků
Značení peptidů stabilními izotopovými značkami
Chromatografická purifikace nebo frakcionace peptidů mikrogradientovým zařízením
Optimalizace chromatografické frakcionace peptidů mikrogradientovým zařízením na SCX fázi
Analýza peptidických vzorků pomocí kombinace kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie
Vyhodnocení získaných experimentálních dat a jejich interpretace
Seznam doporučené literatury
Využití všech dostupných databází Web of Science, NCBI, PubMed, Google Scholar, atd. pro vyhledávání literárních údajů podle pokynů školitele.
Seznam doporučené literatury
Využití všech dostupných databází Web of Science, NCBI, PubMed, Google Scholar, atd. pro vyhledávání literárních údajů podle pokynů školitele.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce.
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce.
3. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP.