Diplomová práce se zabývá proteomickou analýzou biologických vzorků a k tomu využívá metody, které jsou v proteomice běžné k identifikaci, separaci nebo kvantifikaci proteinů a peptidů. Hlavním úkolem praktické části byla izolace protilátek ze séra a jejich následná HPLC nebo LC-MS/MS analýza. Byly analyzovány jak vzorky séra s přídavkem monoklonálních protilátek, tak i vzorky pacientů s mnohočetným myelomem. Dílčím úkolem byl také výběr vhodného postup přípravy sér před vlastní LC-MS/MS analýzou. Při porovnání postupu štěpení vzorků proteolytickými enzymy se ukázalo jako nejvhodnější předizolovat protilátky séra na afinitních nosičích. Další postup přímého štěpení séra nebo separace a frakcionace vzorků pomocí HPLC s následným štěpením nebyly tak výtěžné. Všechny takto připravené vzorky, ať už se jednalo o vzorky definované nebo vzorky pacientů, byly pak úspěšně analyzovány pomocí LC-MS/MS a softwarově vyhodnoceny.
Anotace v angličtině
The thesis deals with proteomic analysis of biological samples and employs methodologies commonly utilized in proteomics to identify, separate, or quantify proteins and peptides. The primary objective of the practical part was the isolation of antibodies from serum and their subsequent HPLC or LC-MS/MS analysis. Serum samples with the addition of monoclonal antibodies and samples from patients with multiple myeloma were analyzed. Another objective of the thesis was to select an appropriate serum preparation procedure prior to the actual LC-MS/MS analysis. A comparison of the cleavage procedures for samples by proteolytic enzymes revealed that pre-isolation of serum antibodies on affinity resins was the most effective approach. Direct cleavage procedures or separation and fractionation of samples by HPLC followed by cleavage were less efficient. All samples prepared in this manner, whether defined or patient samples, were subsequently analyzed successfully by LC-MS/MS and evaluated by software.
Monoclonal antibodies; liquid chromatography; mass spectrometry; multiple myeloma; serum
Rozsah průvodní práce
95 s. (20654 slov)
Jazyk
CZ
Anotace
Diplomová práce se zabývá proteomickou analýzou biologických vzorků a k tomu využívá metody, které jsou v proteomice běžné k identifikaci, separaci nebo kvantifikaci proteinů a peptidů. Hlavním úkolem praktické části byla izolace protilátek ze séra a jejich následná HPLC nebo LC-MS/MS analýza. Byly analyzovány jak vzorky séra s přídavkem monoklonálních protilátek, tak i vzorky pacientů s mnohočetným myelomem. Dílčím úkolem byl také výběr vhodného postup přípravy sér před vlastní LC-MS/MS analýzou. Při porovnání postupu štěpení vzorků proteolytickými enzymy se ukázalo jako nejvhodnější předizolovat protilátky séra na afinitních nosičích. Další postup přímého štěpení séra nebo separace a frakcionace vzorků pomocí HPLC s následným štěpením nebyly tak výtěžné. Všechny takto připravené vzorky, ať už se jednalo o vzorky definované nebo vzorky pacientů, byly pak úspěšně analyzovány pomocí LC-MS/MS a softwarově vyhodnoceny.
Anotace v angličtině
The thesis deals with proteomic analysis of biological samples and employs methodologies commonly utilized in proteomics to identify, separate, or quantify proteins and peptides. The primary objective of the practical part was the isolation of antibodies from serum and their subsequent HPLC or LC-MS/MS analysis. Serum samples with the addition of monoclonal antibodies and samples from patients with multiple myeloma were analyzed. Another objective of the thesis was to select an appropriate serum preparation procedure prior to the actual LC-MS/MS analysis. A comparison of the cleavage procedures for samples by proteolytic enzymes revealed that pre-isolation of serum antibodies on affinity resins was the most effective approach. Direct cleavage procedures or separation and fractionation of samples by HPLC followed by cleavage were less efficient. All samples prepared in this manner, whether defined or patient samples, were subsequently analyzed successfully by LC-MS/MS and evaluated by software.
Monoclonal antibodies; liquid chromatography; mass spectrometry; multiple myeloma; serum
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Mnohočetný myelom a změny zastoupení protilátek v séru.
Zavedené a experimentální metody diagnostiky mnohočetného myelomu.
Metody cílené a globální proteomické analýzy.
Analýza protilátek pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie.
Experimentální část:
Seznámení se základní metodikou proteomické analýzy - stanovení celkové koncentrace proteinů, štěpení proteinů specifickou proteázou, stanovení celkové koncentrace peptidů a LC-MS/MS analýza včetně vyhodnocení dat (buněčný lyzát).
Redukce standardních monoklonálních protilátek (mAb, např. trastuzumab, daratumumab, isatuximab?), izolace a redukce standardních monoklonálních protilátek (mAb) z modelového séra a jejich analýza.
Analýza patologických mAb ze séra pacientů s mnohočetným myelomem.
Proteomická analýza standardních a pacientských mAb pomocí LC-MS/MS a identifikace specifických peptidů variabilní části těžkého řetězce.
Porovnání detekce specifických peptidů variabilní části těžkých řetězců mAb: a) přímo ze séra, b) po specifické izolaci protilátek ze séra a c) po specifické izolaci protilátek ze séra a frakcionaci s využitím HPLC.
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Mnohočetný myelom a změny zastoupení protilátek v séru.
Zavedené a experimentální metody diagnostiky mnohočetného myelomu.
Metody cílené a globální proteomické analýzy.
Analýza protilátek pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie.
Experimentální část:
Seznámení se základní metodikou proteomické analýzy - stanovení celkové koncentrace proteinů, štěpení proteinů specifickou proteázou, stanovení celkové koncentrace peptidů a LC-MS/MS analýza včetně vyhodnocení dat (buněčný lyzát).
Redukce standardních monoklonálních protilátek (mAb, např. trastuzumab, daratumumab, isatuximab?), izolace a redukce standardních monoklonálních protilátek (mAb) z modelového séra a jejich analýza.
Analýza patologických mAb ze séra pacientů s mnohočetným myelomem.
Proteomická analýza standardních a pacientských mAb pomocí LC-MS/MS a identifikace specifických peptidů variabilní části těžkého řetězce.
Porovnání detekce specifických peptidů variabilní části těžkých řetězců mAb: a) přímo ze séra, b) po specifické izolaci protilátek ze séra a c) po specifické izolaci protilátek ze séra a frakcionaci s využitím HPLC.
Seznam doporučené literatury
Využití všech dostupných databází Web of Science, NCBI, PubMed, Google Scholar, atd. pro vyhledávání literárních údajů podle pokynů školitele.
Seznam doporučené literatury
Využití všech dostupných databází Web of Science, NCBI, PubMed, Google Scholar, atd. pro vyhledávání literárních údajů podle pokynů školitele.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Odůvodnění nezveřejnění VŠKP
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce.
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce.
3. Student zodpověděl všechny dotazy a připomínky k diplomové práci.