Diplomová práce byla zaměřena na přípravu magnetického mikroreaktoru s imobilizovanou endoproteinázou Arg-C (Clostripain). Jako vhodné nosiče byly vybrány magnetické částice s karboxylovými, aminovými, hydrazidovými, kyanurátovými a polyglutaraldehydovými funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič, u něhož byla také stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Aktivita solubilního a imobilizovaného Clostripainu byla ověřena pomocí substrátu BAEE (N?-benzoyl-L-arginin-ester). Přírustek produktu byl měřen kineticky jako závislost změny absorbance na čase. Z kinetických údajů byla pro solubilní a imobilizovaný Clostripain stanovena Michaelisova konstanta, charakterizující katalytické vlastnosti enzymu vzhledem k příslušnému substrátu. V poslední části diplomové práce byla ověřena specifita obou forem Clostripainu pomocí štěpení modelového proteinu BSA (hovězí sérový albumin). Byly optimalizovány podmínky enzymové fragmentace (teplota, doba štěpení, poměr E:S). Vzorky byly analyzovány elektroforeticky pomocí SDS-PAGE a pomocí MALDI-TOF-MS.
Anotace v angličtině
Presented thesis was focused on preparation of magnetic microreactor with immobilized endoproteinase Arg-C (Clostripain). Magnetic particles with carboxyl, amino, hydrazide, cyanuric and polyglutaraldehyde function groups were chosen. Based on results, the most convenient carrier was selected, where the storage and operational stability was determined. The substrate BAEE (N?-benzoyl-L-arginin-ester) was used to confirm the activity of soluble and immobilized Clostripain. The product was measured kinetically in time course results in absorbance dependence on time. Michaelis constant (KM) for soluble and immobilized Clostripain was determined. This kinetic parameter characterizes catalytic properties of enzyme in regard of appropriate substrate. Last step of the thesis was to verify the specifity of both Clostripain forms using enzymatic digestion of BSA (bovine serum albumine) as model protein. Conditions of fragmentation (temperature, digestion time, E:S ratio) were optimized. Samples were analyzed by SDS-PAGE and by MALDI-TOF-MS.
endoproteinase Arg-C, Clostripain, immobilization of enzymes, specific endoproteinase
Rozsah průvodní práce
-
Jazyk
CZ
Anotace
Diplomová práce byla zaměřena na přípravu magnetického mikroreaktoru s imobilizovanou endoproteinázou Arg-C (Clostripain). Jako vhodné nosiče byly vybrány magnetické částice s karboxylovými, aminovými, hydrazidovými, kyanurátovými a polyglutaraldehydovými funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič, u něhož byla také stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Aktivita solubilního a imobilizovaného Clostripainu byla ověřena pomocí substrátu BAEE (N?-benzoyl-L-arginin-ester). Přírustek produktu byl měřen kineticky jako závislost změny absorbance na čase. Z kinetických údajů byla pro solubilní a imobilizovaný Clostripain stanovena Michaelisova konstanta, charakterizující katalytické vlastnosti enzymu vzhledem k příslušnému substrátu. V poslední části diplomové práce byla ověřena specifita obou forem Clostripainu pomocí štěpení modelového proteinu BSA (hovězí sérový albumin). Byly optimalizovány podmínky enzymové fragmentace (teplota, doba štěpení, poměr E:S). Vzorky byly analyzovány elektroforeticky pomocí SDS-PAGE a pomocí MALDI-TOF-MS.
Anotace v angličtině
Presented thesis was focused on preparation of magnetic microreactor with immobilized endoproteinase Arg-C (Clostripain). Magnetic particles with carboxyl, amino, hydrazide, cyanuric and polyglutaraldehyde function groups were chosen. Based on results, the most convenient carrier was selected, where the storage and operational stability was determined. The substrate BAEE (N?-benzoyl-L-arginin-ester) was used to confirm the activity of soluble and immobilized Clostripain. The product was measured kinetically in time course results in absorbance dependence on time. Michaelis constant (KM) for soluble and immobilized Clostripain was determined. This kinetic parameter characterizes catalytic properties of enzyme in regard of appropriate substrate. Last step of the thesis was to verify the specifity of both Clostripain forms using enzymatic digestion of BSA (bovine serum albumine) as model protein. Conditions of fragmentation (temperature, digestion time, E:S ratio) were optimized. Samples were analyzed by SDS-PAGE and by MALDI-TOF-MS.
endoproteinase Arg-C, Clostripain, immobilization of enzymes, specific endoproteinase
Zásady pro vypracování
1.Teoretická část:
rešerše o C- terminálních endoproteinázách (Clostripain, Arg- C, Lys- C) se zaměřením na jejich kinetické vlastnosti, způsoby imobilizace na nosiče s různými vlastnostmi, vliv fyzikálně - chemických vlastností nosiče na aktivitu enzymu, a jejich aplikace při studiu proteinů.
2.Praktická část:
a)vytypování vhodného substrátu a zavedení metodiky pro stanovení aktivity solubilního enzymu s ohledem na následné použití pro imobilizovanou formu.
b)optimalizace podmínek imobilizace enzymu na vybrané typy magnetických nosičů s různými funkčními skupinami a vybrání nejúčinnějšího enzymového reaktoru.
c)aplikace připraveného reaktoru pro fragmentaci modelových proteinů různých molekulových hmotností - detekce pomocí SDS - PAGE, příp. hmotnostní spektrometrie.
Zásady pro vypracování
1.Teoretická část:
rešerše o C- terminálních endoproteinázách (Clostripain, Arg- C, Lys- C) se zaměřením na jejich kinetické vlastnosti, způsoby imobilizace na nosiče s různými vlastnostmi, vliv fyzikálně - chemických vlastností nosiče na aktivitu enzymu, a jejich aplikace při studiu proteinů.
2.Praktická část:
a)vytypování vhodného substrátu a zavedení metodiky pro stanovení aktivity solubilního enzymu s ohledem na následné použití pro imobilizovanou formu.
b)optimalizace podmínek imobilizace enzymu na vybrané typy magnetických nosičů s různými funkčními skupinami a vybrání nejúčinnějšího enzymového reaktoru.
c)aplikace připraveného reaktoru pro fragmentaci modelových proteinů různých molekulových hmotností - detekce pomocí SDS - PAGE, příp. hmotnostní spektrometrie.
Seznam doporučené literatury
podle pokynu vedoucího diplomové práce
Seznam doporučené literatury
podle pokynu vedoucího diplomové práce
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce
3. Diplomantka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP