Cílem práce bylo připravit modelový bioafinitní systém použitelný k izolaci specifického ligandu a použít jej ke studiu míry nespecifické sorpce biomolekul a kvantifikaci ligandu. Interagujícím biospecifickým párem byl modelový antigen chymotrypsin a anti-chymotrypsinové protilátky. Zdrojem specifických protilátek bylo odsolené hyperimunní prasečí sérum. Izolace a purifikace byla provedena nespecifickou metodou iontově výměnné chromatografie, a dále specifickými metodami s využitím proteinu A nebo chymotrypsinu kovalentně vázaného k nosiči. Protilátky byly poté imobilizovány na magnetické částice s různými funkčními skupinami (-COOH, -NHNH2, -SH), a to neorientovaným i orientovaným způsobem. Takto zhotovené imunosorbenty byly využity k izolaci afinantu - chymotrypsinu. U připravených imunosorbentů byla studována úspěšnost imobilizace protilátek, k tomu byly použity metody SDS-PAGE, spektrofotometrická, bioafinitní se specifickou protilátkou značenou enzymem (tzv. konjugát). Další charakterizací
zhotovených imunosorbentů bylo jejich využití k izolaci afinantu-chymotrypsinu. U připravených imunosorbentů byla studována nespecifická sorpce. Jako nejúčinnější se jevila inkubace s 1% BSA. Specifické metody vykazovaly větší stupeň adsorbovaných proteinů.
Anotace v angličtině
The aim of this work was to prepare a model bioaffinity system for the isolation of the specific ligand and use it for studying the intensity of a non-specific sorption of the biomolekul and the quantification of ligand. The complementary biospecific pair was a model antigen chymotrypsin and anti-chymotrypsin antibodies. The source of the specific antibodies was a desalting hyperimmune pig's serum. The isolation and the purification was done by a non-specific method of the ionexchange chromatography, then with a specific method by using protein A or chymotrypsin coupled covalently to particles. Then the antibodies were coupled to the magnetic particles with the different functional groups (-COOH, -NHNH2, -SH), namely by a non-oriented and an oriented way. The immunosorbents prepared in this way were studied afterwards for the
efficient immobilization of the antibodies by using SDS-PAGE electrophoresis, the spectrophotometry, the bioaffinity with the specific antibody marked by the enzyme socalled
conjugate. Another characterization of the immunosorbents was its application for the isolation of affinant-chymotrypsin. The immunosorbents were studied for blocking of a non-specific sorption. The most efficient blocking agent was a solution of 1% BSA. Other specific blocking methods embodyed higher degree of a non-specific sorption of proteins.
Cílem práce bylo připravit modelový bioafinitní systém použitelný k izolaci specifického ligandu a použít jej ke studiu míry nespecifické sorpce biomolekul a kvantifikaci ligandu. Interagujícím biospecifickým párem byl modelový antigen chymotrypsin a anti-chymotrypsinové protilátky. Zdrojem specifických protilátek bylo odsolené hyperimunní prasečí sérum. Izolace a purifikace byla provedena nespecifickou metodou iontově výměnné chromatografie, a dále specifickými metodami s využitím proteinu A nebo chymotrypsinu kovalentně vázaného k nosiči. Protilátky byly poté imobilizovány na magnetické částice s různými funkčními skupinami (-COOH, -NHNH2, -SH), a to neorientovaným i orientovaným způsobem. Takto zhotovené imunosorbenty byly využity k izolaci afinantu - chymotrypsinu. U připravených imunosorbentů byla studována úspěšnost imobilizace protilátek, k tomu byly použity metody SDS-PAGE, spektrofotometrická, bioafinitní se specifickou protilátkou značenou enzymem (tzv. konjugát). Další charakterizací
zhotovených imunosorbentů bylo jejich využití k izolaci afinantu-chymotrypsinu. U připravených imunosorbentů byla studována nespecifická sorpce. Jako nejúčinnější se jevila inkubace s 1% BSA. Specifické metody vykazovaly větší stupeň adsorbovaných proteinů.
Anotace v angličtině
The aim of this work was to prepare a model bioaffinity system for the isolation of the specific ligand and use it for studying the intensity of a non-specific sorption of the biomolekul and the quantification of ligand. The complementary biospecific pair was a model antigen chymotrypsin and anti-chymotrypsin antibodies. The source of the specific antibodies was a desalting hyperimmune pig's serum. The isolation and the purification was done by a non-specific method of the ionexchange chromatography, then with a specific method by using protein A or chymotrypsin coupled covalently to particles. Then the antibodies were coupled to the magnetic particles with the different functional groups (-COOH, -NHNH2, -SH), namely by a non-oriented and an oriented way. The immunosorbents prepared in this way were studied afterwards for the
efficient immobilization of the antibodies by using SDS-PAGE electrophoresis, the spectrophotometry, the bioaffinity with the specific antibody marked by the enzyme socalled
conjugate. Another characterization of the immunosorbents was its application for the isolation of affinant-chymotrypsin. The immunosorbents were studied for blocking of a non-specific sorption. The most efficient blocking agent was a solution of 1% BSA. Other specific blocking methods embodyed higher degree of a non-specific sorption of proteins.
Provést literární rešerši
a)nových trendů kovalentní vazby proteinů a jiných biomolekul na pevné nosiče, se zaměřením na imobilizaci specifických protilátek.
b)na řešení problemů nespecifické sorpce biomolekul na nosiče.
c)na nejnovější aplikace bioafinitních reaktorků ve spojení s mikročipovou technologií.
Experimentálně zavést metodu kovalentní vazby ligandu (chymotrypsinu a anti-chymotrypsinových protilátek) na magnetické a nemagnetické nosiče, se sledováním nespecifické sorpce a navržením její minimalizace. Použít připravený bioafinitní nosič k izolaci afinantu s následnou analýzou izolovaných látek s použitím analytických metod SDS-PAGE, případně MS.
Zásady pro vypracování
Provést literární rešerši
a)nových trendů kovalentní vazby proteinů a jiných biomolekul na pevné nosiče, se zaměřením na imobilizaci specifických protilátek.
b)na řešení problemů nespecifické sorpce biomolekul na nosiče.
c)na nejnovější aplikace bioafinitních reaktorků ve spojení s mikročipovou technologií.
Experimentálně zavést metodu kovalentní vazby ligandu (chymotrypsinu a anti-chymotrypsinových protilátek) na magnetické a nemagnetické nosiče, se sledováním nespecifické sorpce a navržením její minimalizace. Použít připravený bioafinitní nosič k izolaci afinantu s následnou analýzou izolovaných látek s použitím analytických metod SDS-PAGE, případně MS.
Seznam doporučené literatury
podle pokynu vedoucího diplomové práce
Seznam doporučené literatury
podle pokynu vedoucího diplomové práce
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce
3. Diplomantka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP