Glutathionreduktáza (GR) je enzym patřící do třídy oxidoreduktáz. Uplatnění nachází při přeměně oxidované formy glutathionu na redukovanou. Glutathion se v organizmu podílí na celé řadě fyziologických a metabolických funkcí. Glutathion především chrání organizmus před oxidačním stresem. Dále pak udržuje vitamíny v redukované formě, podílí se na detoxikaci xenobiotikých látek a transportu aminokyselin přes buněčnou membránu, a udržuje redukční prostředí v erytrocytech.
Nejčastěji využívanými metodami při purifikaci glutathionreduktázy jsou v současnosti precipitace síranem amonným, dialýza a afinitní chromatografie. Cílem naší práce bylo optimalizovat jednotlivé kroky purifikace a jejich parametry, abychom zkrátili čas purifikace a zvýšili její účinnost.
Testovali jsme optimální koncentraci síranu amonného při precipitaci standardu glutathionreduktázy a následně jsme tento pokus opakovali s lidskou krví. V případě precipitace standardu jsme určili jako optimální pro precipitaci glutathionreduktázy rozmezí saturace síranu amonného 50 % až 80 %. Poté jsme testovali optimální saturaci síranu amonného pro precipitaci GR na vzorku se složitější matricí (lyzovaných lidských erytrocytech). V tomto případě byla nalezená optimální saturace v rozmezí 4060 %. Při tomto pokusu bylo zjištěno, že při saturaci 50-60 % síranu amonného precipituje z roztoku lyzovaných erytrocytů většina proteinů. V dalším pokuse jsme navázali standard glutathionreduktázy na stacionární fázi afinitní chromatografie (2´,5´-ADP-agrarózu). Následně jsme provedli eluci GR, zachycení eluované mobilní fáze do mikrozkumavek a stanovení aktivity GR a koncentrace proteinů v eluovaném roztoku. V rámci další práce byla provedena kompletní purifikace glutathionreduktázy z odebraného vzorku krve. V tomto pokusu jsme získali glutathionreduktázu z lyzovaných lidských erytrocytů pomocí precipitace síranem amonným, dialýzy a afinitní chromatografie s výtěžkem 23 % a se stupněm očištění 4780.
Anotace v angličtině
Glutathione reductase (GR) is an enzyme belonging to the class of oxidoreductases. It is used in the conversion of oxidized glutathione to reduced form. Glutathione in the organism participates in a number of physiological and metabolic functions. Glutathione primarily protects the body against oxidative stress. Furthermore keeps vitamins in reduced form, is involved in the detoxification xenobiotic substances and amino acid transport across the cell membrane and maintains a reducing environment in erythrocytes.
The most commonly used methods for purification of glutathione reductase are currently ammonium sulfate precipitation, dialysis, and affinity chromatography. The aim of our study was to optimize the individual purification steps and their parameters to shorten the time for purification and increase its effectiveness.
We tested the optimal concentration of ammonium sulfate for precipitation at standard of glutathione reductase and consequently we repeated the experiment with human blood. In the case of standard precipitation we had identified as optimal for the precipitation of glutathione reudctase ranging saturation of ammonium sulfate of 50 % to 80 %. After that we tested the optimal saturation of ammonium sulfate for precipitation GR sample with complex matrices (lysed human erythrocytes). In this case, it was found optimal saturation of 40-60%. In this experiment it was found that most proteins are precipitated from the solution of lysed erythrocytes between 50 to 60% saturation of ammonium sulphate. In another experiment, we purified standard of glutathione reductase using 2', 5'-ADP-agrarose as the stationary phase for affinity chromatography. Subsequently, the elution was performed, the eluted mobile phase was captured into microtubes and glutathion reductase activity and concentration of proteins in the eluted solution was determined. In a further work was done complete purification of glutathione from the blood sample. In this experiment, we obtained glutathione reductase from lysed human erythrocytes using ammonium sulfate precipitation, dialysis, and affinity chromatography with a yield of 23% and purification fold 4780.
Glutathionreduktáza (GR) je enzym patřící do třídy oxidoreduktáz. Uplatnění nachází při přeměně oxidované formy glutathionu na redukovanou. Glutathion se v organizmu podílí na celé řadě fyziologických a metabolických funkcí. Glutathion především chrání organizmus před oxidačním stresem. Dále pak udržuje vitamíny v redukované formě, podílí se na detoxikaci xenobiotikých látek a transportu aminokyselin přes buněčnou membránu, a udržuje redukční prostředí v erytrocytech.
Nejčastěji využívanými metodami při purifikaci glutathionreduktázy jsou v současnosti precipitace síranem amonným, dialýza a afinitní chromatografie. Cílem naší práce bylo optimalizovat jednotlivé kroky purifikace a jejich parametry, abychom zkrátili čas purifikace a zvýšili její účinnost.
Testovali jsme optimální koncentraci síranu amonného při precipitaci standardu glutathionreduktázy a následně jsme tento pokus opakovali s lidskou krví. V případě precipitace standardu jsme určili jako optimální pro precipitaci glutathionreduktázy rozmezí saturace síranu amonného 50 % až 80 %. Poté jsme testovali optimální saturaci síranu amonného pro precipitaci GR na vzorku se složitější matricí (lyzovaných lidských erytrocytech). V tomto případě byla nalezená optimální saturace v rozmezí 4060 %. Při tomto pokusu bylo zjištěno, že při saturaci 50-60 % síranu amonného precipituje z roztoku lyzovaných erytrocytů většina proteinů. V dalším pokuse jsme navázali standard glutathionreduktázy na stacionární fázi afinitní chromatografie (2´,5´-ADP-agrarózu). Následně jsme provedli eluci GR, zachycení eluované mobilní fáze do mikrozkumavek a stanovení aktivity GR a koncentrace proteinů v eluovaném roztoku. V rámci další práce byla provedena kompletní purifikace glutathionreduktázy z odebraného vzorku krve. V tomto pokusu jsme získali glutathionreduktázu z lyzovaných lidských erytrocytů pomocí precipitace síranem amonným, dialýzy a afinitní chromatografie s výtěžkem 23 % a se stupněm očištění 4780.
Anotace v angličtině
Glutathione reductase (GR) is an enzyme belonging to the class of oxidoreductases. It is used in the conversion of oxidized glutathione to reduced form. Glutathione in the organism participates in a number of physiological and metabolic functions. Glutathione primarily protects the body against oxidative stress. Furthermore keeps vitamins in reduced form, is involved in the detoxification xenobiotic substances and amino acid transport across the cell membrane and maintains a reducing environment in erythrocytes.
The most commonly used methods for purification of glutathione reductase are currently ammonium sulfate precipitation, dialysis, and affinity chromatography. The aim of our study was to optimize the individual purification steps and their parameters to shorten the time for purification and increase its effectiveness.
We tested the optimal concentration of ammonium sulfate for precipitation at standard of glutathione reductase and consequently we repeated the experiment with human blood. In the case of standard precipitation we had identified as optimal for the precipitation of glutathione reudctase ranging saturation of ammonium sulfate of 50 % to 80 %. After that we tested the optimal saturation of ammonium sulfate for precipitation GR sample with complex matrices (lysed human erythrocytes). In this case, it was found optimal saturation of 40-60%. In this experiment it was found that most proteins are precipitated from the solution of lysed erythrocytes between 50 to 60% saturation of ammonium sulphate. In another experiment, we purified standard of glutathione reductase using 2', 5'-ADP-agrarose as the stationary phase for affinity chromatography. Subsequently, the elution was performed, the eluted mobile phase was captured into microtubes and glutathion reductase activity and concentration of proteins in the eluted solution was determined. In a further work was done complete purification of glutathione from the blood sample. In this experiment, we obtained glutathione reductase from lysed human erythrocytes using ammonium sulfate precipitation, dialysis, and affinity chromatography with a yield of 23% and purification fold 4780.
1.) Zpracujte literární rešerši zaměřenou na podrobný popis funkce glutathionreduktasy (GR), její lokalizaci v buňce a význam v buněčném metabolismu. Dále se zaměřte na shrnutí možností purifikace tohoto enzymu z biologického materiálu, popř. na přípravu přehledu různých metod používaných k purifikaci enzymů obecně. Ke zpracování tohoto přehledu využijte elektronické databáze (ScienceDirect, NCBI Pubmed, HighWire).
2.) Na základě získaných poznatků optimalizujte jednotlivé kroky purifikace glutathionreduktasy z biologického materiálu. K testování nejprve využijte komerční enzym, následně pak biologický materiál (krev, játra, či lyzát buněk apod.). Při práci se zaměřte na optimalizaci jednotlivých kroků purifikace - např. na míru a délku precipitace proteinů, teplotní a časovou stabilitu aktivity, možnosti filtrace (separační komory vs. centrifugační zkumavky), apod.
3.) Použitím optimálních podmínek purifikace vypracujte metodu a u ní stanovte parametry purifikace - tj. specifickou enzymovou aktivitu, % výtěžek, stupeň přečištění proteinů, atd. Ke zjištění specifické aktivity enzymu využijte stanovení proteinů dle Bradforda.
4.) Získaná experimentální data statisticky zpracujte a diskutujte. Své výsledky následně porovnejte s výstupy jiných autorů.
Zásady pro vypracování
1.) Zpracujte literární rešerši zaměřenou na podrobný popis funkce glutathionreduktasy (GR), její lokalizaci v buňce a význam v buněčném metabolismu. Dále se zaměřte na shrnutí možností purifikace tohoto enzymu z biologického materiálu, popř. na přípravu přehledu různých metod používaných k purifikaci enzymů obecně. Ke zpracování tohoto přehledu využijte elektronické databáze (ScienceDirect, NCBI Pubmed, HighWire).
2.) Na základě získaných poznatků optimalizujte jednotlivé kroky purifikace glutathionreduktasy z biologického materiálu. K testování nejprve využijte komerční enzym, následně pak biologický materiál (krev, játra, či lyzát buněk apod.). Při práci se zaměřte na optimalizaci jednotlivých kroků purifikace - např. na míru a délku precipitace proteinů, teplotní a časovou stabilitu aktivity, možnosti filtrace (separační komory vs. centrifugační zkumavky), apod.
3.) Použitím optimálních podmínek purifikace vypracujte metodu a u ní stanovte parametry purifikace - tj. specifickou enzymovou aktivitu, % výtěžek, stupeň přečištění proteinů, atd. Ke zjištění specifické aktivity enzymu využijte stanovení proteinů dle Bradforda.
4.) Získaná experimentální data statisticky zpracujte a diskutujte. Své výsledky následně porovnejte s výstupy jiných autorů.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce (DP).
2. Diskuze k posudku vedoucího a oponenta DP.
3. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP.