Fluorescenční buněčné sondy nacházejí v dnešní době své místo především ve výzkumu, i když stále častěji se s nimi můžeme setkat i v klinické praxi. V dnešní době existuje nepřeberné množství takovýchto fluorescenčních sond. Existují sondy pro detekci mitochondriálního potenciálu, nukleových kyselin, produkce ROS atd. Cílem naší práce bylo optimalizovat použití fluorescenčních sond (JC-1, JC-10, Hoechst 33258, CM-H2DCFDA a annexinu V s propidium jodidem), porovnat sondy JC-1, JC-10 a v neposlední řadě použít fluorescenční sondy k charakterizaci modelového buněčného poškození in vitro.
V naší práci jsme optimalizovali dobu loadingu sondy JC-1 na hepatomových buňkách HepG2 a buňkách lidského adenokarcinomu A549. Jako optimální jsme určili 30minutovou inkubaci. Tuto dobu loadingu jsme poté použili i u buněk renální linie HK-2. Dále jsme sledovali stabilitu sond JC-1 a JC-10 v čase, kde se ukázalo, že sonda JC-1 je poměrně stabilní oproti sondě JC-10, u níž jsme prokázali vysokou nestabilitu fluorescence. V rámci další práce jsme zavedli stanovení pomocí sond pro detekci nukleových kyselin (Hoechst 33258, propidium jodid), produkce ROS (CM-H2DCFDA) a apoptózy (annexin V) s využitím fluorescenční mikroskopie. Výše uvedené fluorescenční sondy byly použity u buněk renální linie HK-2, které byly ovlivněné acetaminofenem (0, 1 mM). Z fluorescenčních obrázků byla jasně patrná specifita každé z fluorescenčních sond. S použitím sondy Hoechst 33258 bylo zjištěno, že již při inkubaci s 1 ?M acetaminofenem dochází k fragmentaci buněčných jader a fluorescence závislá na této sondě se kumuluje na okraji buňky.
Anotace v angličtině
Cellular fluorescent probes have been used especially in the research, even though they are also increasingly occuring in the clinical practices. Presently, a number of various fluorescent probes appear, such as probes for the mitochondrial potential detection, nucleic acids, ROS production etc. The aim of our diploma thesis was 1) to optimize the utilization of these fluorescent probes JC-1, JC-10, Hoechst 33258, CM-H2DCFDA and annexin V with propidium iodide, 2) to compare JC-1, JC-10 probes and, finally, 3) to apply the fluorescent probes in characterization of cellular damage in vitro.
In our diploma thesis we have optimized the duration of JC-1 probe loading in human HepG2 and A549 cells. We have determined the 30-minutes incubation as optimal. We used the same loading time also for the HK-2 renal cell line. In addition, we observed the fluorescence stability of JC-1 and JC-10 probes. We found that JC-1 probe was relatively stable compared to JC-10 probe that demonstrated the high instability of fluorescence. Within our next study, we introduced the assessment using probes for the nucleic acids detection (Hoechst 33258, propidium iodide), ROS production (CM-H2DCFDA) and apoptosis (annexin V) with the utilization of fluorescent microscopy. Consequently, all fluorescent probes were used in characterization of acetaminophen toxicity in HK-2 cells. The specificity of fluorescent probe was clearly visible at fluorescence pictures. After acetaminophen incubation, we found the fragmentation of cell nucleus and Hoechst 33258 fluorescence on the cell edge of the cell. Our results showed that the use of intracellular fluorescent probes in well for the characterization of cell damage in vitro.
Fluorescenční buněčné sondy nacházejí v dnešní době své místo především ve výzkumu, i když stále častěji se s nimi můžeme setkat i v klinické praxi. V dnešní době existuje nepřeberné množství takovýchto fluorescenčních sond. Existují sondy pro detekci mitochondriálního potenciálu, nukleových kyselin, produkce ROS atd. Cílem naší práce bylo optimalizovat použití fluorescenčních sond (JC-1, JC-10, Hoechst 33258, CM-H2DCFDA a annexinu V s propidium jodidem), porovnat sondy JC-1, JC-10 a v neposlední řadě použít fluorescenční sondy k charakterizaci modelového buněčného poškození in vitro.
V naší práci jsme optimalizovali dobu loadingu sondy JC-1 na hepatomových buňkách HepG2 a buňkách lidského adenokarcinomu A549. Jako optimální jsme určili 30minutovou inkubaci. Tuto dobu loadingu jsme poté použili i u buněk renální linie HK-2. Dále jsme sledovali stabilitu sond JC-1 a JC-10 v čase, kde se ukázalo, že sonda JC-1 je poměrně stabilní oproti sondě JC-10, u níž jsme prokázali vysokou nestabilitu fluorescence. V rámci další práce jsme zavedli stanovení pomocí sond pro detekci nukleových kyselin (Hoechst 33258, propidium jodid), produkce ROS (CM-H2DCFDA) a apoptózy (annexin V) s využitím fluorescenční mikroskopie. Výše uvedené fluorescenční sondy byly použity u buněk renální linie HK-2, které byly ovlivněné acetaminofenem (0, 1 mM). Z fluorescenčních obrázků byla jasně patrná specifita každé z fluorescenčních sond. S použitím sondy Hoechst 33258 bylo zjištěno, že již při inkubaci s 1 ?M acetaminofenem dochází k fragmentaci buněčných jader a fluorescence závislá na této sondě se kumuluje na okraji buňky.
Anotace v angličtině
Cellular fluorescent probes have been used especially in the research, even though they are also increasingly occuring in the clinical practices. Presently, a number of various fluorescent probes appear, such as probes for the mitochondrial potential detection, nucleic acids, ROS production etc. The aim of our diploma thesis was 1) to optimize the utilization of these fluorescent probes JC-1, JC-10, Hoechst 33258, CM-H2DCFDA and annexin V with propidium iodide, 2) to compare JC-1, JC-10 probes and, finally, 3) to apply the fluorescent probes in characterization of cellular damage in vitro.
In our diploma thesis we have optimized the duration of JC-1 probe loading in human HepG2 and A549 cells. We have determined the 30-minutes incubation as optimal. We used the same loading time also for the HK-2 renal cell line. In addition, we observed the fluorescence stability of JC-1 and JC-10 probes. We found that JC-1 probe was relatively stable compared to JC-10 probe that demonstrated the high instability of fluorescence. Within our next study, we introduced the assessment using probes for the nucleic acids detection (Hoechst 33258, propidium iodide), ROS production (CM-H2DCFDA) and apoptosis (annexin V) with the utilization of fluorescent microscopy. Consequently, all fluorescent probes were used in characterization of acetaminophen toxicity in HK-2 cells. The specificity of fluorescent probe was clearly visible at fluorescence pictures. After acetaminophen incubation, we found the fragmentation of cell nucleus and Hoechst 33258 fluorescence on the cell edge of the cell. Our results showed that the use of intracellular fluorescent probes in well for the characterization of cell damage in vitro.
1.) Zpracujte literární rešerši zaměřenou na popis intracelulárních fluorescenčních sond. Jmenovitě se zaměřte na jejich výčet, rozdělení, porovnání vlastností a také na možnosti jejich využití při hodnocení buněčného poškození in vitro. Především uveďte sondy sloužící k hodnocení funkčního stavu mitochondrií a morfologických změn v buněčném jádře. Ke zpracování tohoto přehledu využijte elektronické databáze (ScienceDirect, NCBI Pubmed, Web of Science).
2.) V rámci praktické části:
a) optimalizujte použití minimálně třech sond (např. JC-1, JC-10 a Hoechst, DAPI, DCFDA) u buněčných linií pomocí fluorescenční mikroskopie.
b) porovnejte mikroskopické použití, tj. výhody a nevýhody sond JC-1 vs. JC-10 s následnou spektrofluorimetrickou analýzou v destičkovém uspořádání.
3.) Použijte nejméně dva typy sond k charakterizaci modelového buněčného poškození in vitro a určete, zda se na testované toxicitě podílejí i děje proapoptické či oxidační.
4.) Získaná experimentální data statisticky zpracujte a diskutujte. Své výsledky následně porovnejte s výstupy jiných autorů.
Zásady pro vypracování
1.) Zpracujte literární rešerši zaměřenou na popis intracelulárních fluorescenčních sond. Jmenovitě se zaměřte na jejich výčet, rozdělení, porovnání vlastností a také na možnosti jejich využití při hodnocení buněčného poškození in vitro. Především uveďte sondy sloužící k hodnocení funkčního stavu mitochondrií a morfologických změn v buněčném jádře. Ke zpracování tohoto přehledu využijte elektronické databáze (ScienceDirect, NCBI Pubmed, Web of Science).
2.) V rámci praktické části:
a) optimalizujte použití minimálně třech sond (např. JC-1, JC-10 a Hoechst, DAPI, DCFDA) u buněčných linií pomocí fluorescenční mikroskopie.
b) porovnejte mikroskopické použití, tj. výhody a nevýhody sond JC-1 vs. JC-10 s následnou spektrofluorimetrickou analýzou v destičkovém uspořádání.
3.) Použijte nejméně dva typy sond k charakterizaci modelového buněčného poškození in vitro a určete, zda se na testované toxicitě podílejí i děje proapoptické či oxidační.
4.) Získaná experimentální data statisticky zpracujte a diskutujte. Své výsledky následně porovnejte s výstupy jiných autorů.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Podle pokynů vedoucího diplomové práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1.Prezentace výsledků diplomové práce. 2. Přečtení posudků vedoucího a oponenta diplomové práce. 3. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce. 4. Student odpovídal na všechny dotazy a připomínky k DP.