Cílem diplomové práce bylo zavést metodu elektrochemického stanovení aktivity enzymu proteinkinázy A, a to solubilní a imobilizované na magnetických částicích. Stanovení bylo založeno na square-wave voltametrické analýze nanočástic koloidního zlata (AuNPs), které byly použity jako elektroaktivní částice selektivně navázané na fosforylovaný substrát. Solubilní i imobilizovaná forma proteinkinázy A byla použita k in vitro fosforylaci Kemptide a biotin-Kemptide. Účinnost fosforylace byla ověřena také pomocí metody MALDI-Orbitrap hmotnostní spektrometrie.
Anotace v angličtině
The aim of the thesis was to implementat a method of electrochemical determination of enzyme activity of proteinkinase A, namely soluble form and immobilized form on magnetic particles. The determination was based on square-wave voltammetric analysis of colloidal gold nanoparticles (AuNPs), which were used as electroactive particles selectively bound to a phosphorylated substrate. Both forms of proteinkinase A were used for in vitro phosphorylation of Kemptide and biotin-Kemptide. The phosphorylation efficiency was also verified by MALDI-Orbitrap mass spectrometry.
Cílem diplomové práce bylo zavést metodu elektrochemického stanovení aktivity enzymu proteinkinázy A, a to solubilní a imobilizované na magnetických částicích. Stanovení bylo založeno na square-wave voltametrické analýze nanočástic koloidního zlata (AuNPs), které byly použity jako elektroaktivní částice selektivně navázané na fosforylovaný substrát. Solubilní i imobilizovaná forma proteinkinázy A byla použita k in vitro fosforylaci Kemptide a biotin-Kemptide. Účinnost fosforylace byla ověřena také pomocí metody MALDI-Orbitrap hmotnostní spektrometrie.
Anotace v angličtině
The aim of the thesis was to implementat a method of electrochemical determination of enzyme activity of proteinkinase A, namely soluble form and immobilized form on magnetic particles. The determination was based on square-wave voltammetric analysis of colloidal gold nanoparticles (AuNPs), which were used as electroactive particles selectively bound to a phosphorylated substrate. Both forms of proteinkinase A were used for in vitro phosphorylation of Kemptide and biotin-Kemptide. The phosphorylation efficiency was also verified by MALDI-Orbitrap mass spectrometry.
Teoretická část:
Informace o enzymech podílejících se na fosforylaci proteinů se zaměřením na proteinkinázu A (PKA) - struktura, funkce, reakční mechanismus, výskyt
Metody studia enzymové aktivity kináz a fosforylace proteinů
Možnosti monitorování enzymové aktivity PKA elektrochemicky - detekční metoda, elektrody, uspořádání
Experimentální část:
Fosforylace substrátu Kemptide solubilní PKA v čase a ověření pomocí hmotnostní spektrometrie.
Imobilizace PKA na magnetické částice, fosforylace substrátu imobilizovanou kinázou a ověření pomocí hmotnostní spektrometrie.
Zavedení metody elektrochemické detekce fosforylovaného substrátu - volba vhodné elektrody, detekční metody, optimalizace podmínek, modifikace pracovní elektrody. Porovnání účinnosti fosforylace pomocí solubilní a imobilizované PKA.
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Informace o enzymech podílejících se na fosforylaci proteinů se zaměřením na proteinkinázu A (PKA) - struktura, funkce, reakční mechanismus, výskyt
Metody studia enzymové aktivity kináz a fosforylace proteinů
Možnosti monitorování enzymové aktivity PKA elektrochemicky - detekční metoda, elektrody, uspořádání
Experimentální část:
Fosforylace substrátu Kemptide solubilní PKA v čase a ověření pomocí hmotnostní spektrometrie.
Imobilizace PKA na magnetické částice, fosforylace substrátu imobilizovanou kinázou a ověření pomocí hmotnostní spektrometrie.
Zavedení metody elektrochemické detekce fosforylovaného substrátu - volba vhodné elektrody, detekční metody, optimalizace podmínek, modifikace pracovní elektrody. Porovnání účinnosti fosforylace pomocí solubilní a imobilizované PKA.
Seznam doporučené literatury
Recentní literatura dostupná v databázi WoS, MEDLINE, Sciencedirect; odborné knihy. Další dle pokynů vedoucí diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Recentní literatura dostupná v databázi WoS, MEDLINE, Sciencedirect; odborné knihy. Další dle pokynů vedoucí diplomové práce.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce.
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce.
3. Student/ka zodpověděl/a všechny dotazy a připomínky k DP.