Diplomová práce byla zaměřena na zavedení metody stanovení aktivity proteolytického enzymu Clostripainu, optimalizaci reakčních podmínek, imobilizaci na vhodný magnetický nosič a jeho následné použití pro fragmentaci tau proteinu. Aktivita Clostripainu byla měřena pomocí chromogenního substrátu BApNA (N-?-benzoyl-D, L-arginin-p-nitroanilid). Byly optimalizovány reakční podmínky Clostripainu, a to doba aktivace enzymu, optimální reakční teplota a čas, poměr E:S. Pro imobilizaci byly vyzkoušeny různé metody kovalentní vazby. Z magnetických nosičů pro imobilizaci Clostripainu byly vybrány magnetické částice Chemicell s karboxylovými, aminovými, polyglutaraldehydovými, hydrazinovými a kyanurátovými funkčními skupinami a magnetická makroporézní perlová celulóza s -OH funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič a byla u něj stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Specifita štěpení imobilizovaným Clostripainem byla nejprve ověřena pomocí modelového proteinu melittinu, a poté byl nosič aplikován pro fragmentaci tau proteinu. Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy a MALDI-TOF-MS.
Anotace v angličtině
Presented thesis was focused on implementation of suitable method for determination of Clostripain activity, optimization of reaction conditions, immobilization onto appropriate magnetic carriers and its subsequent use for fragmentaion of tau protein. The low molecular mass substrate BApNA (N-?-benzoyl-D, L-arginin-p-nitroanilid) was used for confirmation of the activity of Clostripain. Reaction conditions of Clostripain, such as time of activation, the optimal temperature of reaction and the ratio of E:S were optimized. Various methods of covalent bonding were tested. Magnetic particles with carboxyl, amino, polyglutaraldehyde, hydrazide and cyanuric groups and magnetic macroporous bead celulose with carboxyl groups were chosen as carriers for Clostripain immobilization. Various methods of immobilization by covalent bond were tested. Based on the results, the most convenient carrier was selected, where the storage and operational stability were determined. Specifity of enzymatic digestion of immobilized Clostripain was verified using Melisin as model protein and then was carrier applied to the fragmentation of tau protein. Samples were analyzed by SDS-PAGE and by MALDI-TOF-MS.
Klíčová slova
Clostripain, endoproteináza Arg-C, magnetické částice, tau protein, Alzheimerova choroba
Klíčová slova v angličtině
Clostripain, endoproteinase Arg-C, magnetic particles, tau protein, Alzheimer's disease
Rozsah průvodní práce
-
Jazyk
CZ
Anotace
Diplomová práce byla zaměřena na zavedení metody stanovení aktivity proteolytického enzymu Clostripainu, optimalizaci reakčních podmínek, imobilizaci na vhodný magnetický nosič a jeho následné použití pro fragmentaci tau proteinu. Aktivita Clostripainu byla měřena pomocí chromogenního substrátu BApNA (N-?-benzoyl-D, L-arginin-p-nitroanilid). Byly optimalizovány reakční podmínky Clostripainu, a to doba aktivace enzymu, optimální reakční teplota a čas, poměr E:S. Pro imobilizaci byly vyzkoušeny různé metody kovalentní vazby. Z magnetických nosičů pro imobilizaci Clostripainu byly vybrány magnetické částice Chemicell s karboxylovými, aminovými, polyglutaraldehydovými, hydrazinovými a kyanurátovými funkčními skupinami a magnetická makroporézní perlová celulóza s -OH funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič a byla u něj stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Specifita štěpení imobilizovaným Clostripainem byla nejprve ověřena pomocí modelového proteinu melittinu, a poté byl nosič aplikován pro fragmentaci tau proteinu. Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy a MALDI-TOF-MS.
Anotace v angličtině
Presented thesis was focused on implementation of suitable method for determination of Clostripain activity, optimization of reaction conditions, immobilization onto appropriate magnetic carriers and its subsequent use for fragmentaion of tau protein. The low molecular mass substrate BApNA (N-?-benzoyl-D, L-arginin-p-nitroanilid) was used for confirmation of the activity of Clostripain. Reaction conditions of Clostripain, such as time of activation, the optimal temperature of reaction and the ratio of E:S were optimized. Various methods of covalent bonding were tested. Magnetic particles with carboxyl, amino, polyglutaraldehyde, hydrazide and cyanuric groups and magnetic macroporous bead celulose with carboxyl groups were chosen as carriers for Clostripain immobilization. Various methods of immobilization by covalent bond were tested. Based on the results, the most convenient carrier was selected, where the storage and operational stability were determined. Specifity of enzymatic digestion of immobilized Clostripain was verified using Melisin as model protein and then was carrier applied to the fragmentation of tau protein. Samples were analyzed by SDS-PAGE and by MALDI-TOF-MS.
Klíčová slova
Clostripain, endoproteináza Arg-C, magnetické částice, tau protein, Alzheimerova choroba
Klíčová slova v angličtině
Clostripain, endoproteinase Arg-C, magnetic particles, tau protein, Alzheimer's disease
Zásady pro vypracování
1) Teoretická část:
Zpracovat teoretickou rešerši o enzymu Clostripainu, možnostech jeho imobilizace na pevné nosiče (se zaměřením na magnetické) a jeho využití v proteomice.
Zpracovat kapitolu o Tau proteinu, jeho významu v diagnostice Alzheimerovy choroby a možnostech jeho stanovení.
2) Praktická část:
a) Zavedení metody pro stanovení proteolytické aktivity solubilního Clostripainu pomocí chromogenního nízkomolekulárního substrátu
b) optimalizace podmínek imobilizace Clostripainu na různé druhy magnetických nosičů
c) optimalizace reakčních podmínek solubilního i imobilizovaného enzymu pomocí modelového systému
d) fragmentace Tau proteinu, detekce pomocí SDS-PAGE a MALDI-TOF/MS
Zásady pro vypracování
1) Teoretická část:
Zpracovat teoretickou rešerši o enzymu Clostripainu, možnostech jeho imobilizace na pevné nosiče (se zaměřením na magnetické) a jeho využití v proteomice.
Zpracovat kapitolu o Tau proteinu, jeho významu v diagnostice Alzheimerovy choroby a možnostech jeho stanovení.
2) Praktická část:
a) Zavedení metody pro stanovení proteolytické aktivity solubilního Clostripainu pomocí chromogenního nízkomolekulárního substrátu
b) optimalizace podmínek imobilizace Clostripainu na různé druhy magnetických nosičů
c) optimalizace reakčních podmínek solubilního i imobilizovaného enzymu pomocí modelového systému
d) fragmentace Tau proteinu, detekce pomocí SDS-PAGE a MALDI-TOF/MS
Seznam doporučené literatury
podle pokynů vedoucího diplomové práce
Seznam doporučené literatury
podle pokynů vedoucího diplomové práce
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
1. Prezentace výsledků diplomové práce
2. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce
3. Diplomantka zodpověděla všechny dotazy a přípomínky k DP